Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α

BÙI THỊ THANH TỊNH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, “Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α”, đƣợc thƣc hiện tại Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh và Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật-Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.

Giáo viên hƣớng dẫn: thầy Lê Đình Đôn.

Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 02 năm 2006 đến tháng 08 năm 2006 với các nội dung:

Hoàn thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp theo phƣơng pháp sử dụng hoá chất.

Hoàn thiện quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α..Hoàn thiện quy trình chiết tách plasmid, phản ứng cắt plasmid để kiểm tra.Thiết lập

phản ứng phủ đầu bằng cho đoạn DNA từ phản ứng PCR và plasmid sau khi cắt.

Thiết lập phản ứng chèn đoạn DNA vào plasmid pBluescript.

Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

Thiết lập đƣợc quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hoá chất, tế bào khả nạp có thể giữ ở -70oC với glycerol trong thời gian 2 tháng.

Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli DH5α.

Chiết tách plasmid không lẫn tạp theo quy trình của Sambrook và cộng sự có sửa đổi

NỘI DUNG:

PHẦN 1. MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1

1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1

1.2 Mục tiêu của đề tài................................................................................................ 2

1.3 Nội dung thực hiện ............................................................................................... 2

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3

2.1 Hiện tƣơng biến nạp ở vi khuẩn ........................................................................... 3

2.1.1 Giới thiệu về hiện tƣợng biến nạp ................................................................ 3

2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tƣợng biến nạp ................................ 3

2.1.3 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp ................................................................... 5

2.1.4 Vai trò của hiện tƣợng biến nạp ................................................................... 5

2.1.5 Ứng dụng của hiện tƣợng biến nạp .............................................................. 5

2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp ..................................................... 6

2.2.1 Khái niệm chung các vector ......................................................................... 6

2.2.2 Plasmid ......................................................................................................... 7

2.2.2.1 Cấu trúc ............................................................................................... 7

2.2.2.2 Tính chất của plasmid .......................................................................... 8

2.2.2.3 Phân loại plasmid ................................................................................ 8

2.2.3 Phage ............................................................................................................ 9

2.2.4 Chủng chủ E.coli .......................................................................................... 9

2.3 Các ezyme dùng trong biến nạp ......................................................................... 10

2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) ..................................................................... 11

iv

2.3.1.1 Hiện tƣợng giới hạn ........................................................................... 11

2.3.1.2 Tên gọi các RE .................................................................................. 11

2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn .................................................................... 12

2.3.1.4 Các RE loại II .................................................................................... 12

2.3.2 Các enzym thông dụng khác ...................................................................... 15

2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) ........................................................ 15

2.3.2.2 Taq polymerase ................................................................................. 15

2.3.2.3 Terminal transferase .......................................................................... 15

2.3.2.4 Các DNase ......................................................................................... 15

2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa ......................................................... 16

2.3.3 Các enzym nối DNA .................................................................................. 16

2.3.3.1 E.coli DNA ligase .............................................................................. 16

2.3.3.2 T4 DNA ligase ................................................................................... 16

2.4 Các phƣơng pháp sử dụng trong biến nạp .......................................................... 17

2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp ............................................................................. 17

2.4.1.1 Phƣơng pháp hóa biến nạp ................................................................ 17

2.4.1.2 Phƣơng pháp điện biến nạp ............................................................... 18

2.4.2 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp ................... 18

2.4.3 Chiết tách DNA plasmid ............................................................................ 19

2. 5 Điện di (Electrophoresis) ................................................................................... 19

2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nƣớc và ngoài nƣớc .................................. 20

2.6.1 Ngoài nƣớc ................................................................................................. 20

2.6.2 Trong nƣớc ................................................................................................. 21

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 22

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp ....................................... 22

3.2 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 22

3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α............................................................................... 22

3.2.2 pBluescript II SK(+/-) ................................................................................ 22

3.2.3 Đoạn DNA ................................................................................................. 23

3.3 Dụng cụ và hóa chất ........................................................................................... 23

3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm .................................................................................... 23

v

3.3.2 Các thiết bị máy móc ................................................................................. 23

3.3.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn ...................................................... 23

3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm ................................................... 24

3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm ...................................................... 24

3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 25

3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ....................................... 25

3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn

E.coli DH5α và kiểm tra .......................................................................... 26

3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E.coli DH5α trên môi trƣờng LB ............................... 27

3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp ............................................................................. 27

3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn

E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt

(theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) ................................. 27

3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra ............................... 29

3.4.6.1 Chiết tách plasmid ............................................................................. 29

3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid

(quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) ................................ ...... 32

3.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose ..................................................... 32

3.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR .................................. 33

3.4.7.1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA ............................................................. 33

3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel ........................................................ 33

3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX ................... 34

3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR ............................... 35

3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn

DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) ................................................ 36

3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α

khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) ............ 37

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 38

4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn .......................................... 38

4.2 Tách chiết DNA plasmid .................................................................................... 40

4.2.1 Tách chiết DNA plasmid ........................................................................... 40

vi

4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng Aurum

TM

Plasmid Mini Kit ..................... 42

4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV ................................... 42

4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII ................................ 44

4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA.................................................................................. 44

4.4.2 Tinh sạch plasmid ...................................................................................... 45

4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp ................................................................................ 46

4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp ............................................................................. 46

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 48

5.1 Kết luận ............................................................................................................... 48

5.2 Kiến nghị

LƯU Ý:

Tài liệu được chia sẻ bởi CTV EBOOKBKMT "Mân Trần Lê" chỉ được dùng phục vụ mục đích học tập và nghiên cứu.

LINK DOWNLOAD