GIÁO TRÌNH - Kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử - TS. Phạm Hồng Sơn | Cộng đồng Kỹ thuật cơ điện Việt Nam EBOOKBKMT

Tuy những thành quả nghiên cứu như thực phẩm biến đổi gen (GMF - genetically modified food) đ. có trên bàn ăn cũng như bàn nghị sự của nhiều nước trên thế giới, và nhiều thành quả khác đ. được vận dụng khá rộng r.i trong y học và nông nghiệp, sinh học phân tử vẫn c.n là lĩnh vực khá mới mẻ đối với nhiều trường đại học nước ta. Để đáp ứng nhu cầu tiếp cận nghiên cứu, phát triển và ứng dụng lĩnh vực này cần có một tài liệu thực hành sinh học phân tử bằng tiếng Việt. Đó là l. do ra đời cuốn giáo tr.nh này. Là tài liệu hướng dẫn kỹ thuật, giáo tr.nh này đương nhiên giới thiệu các bước kỹ thuật thường được thực hiện trong sinh học phân tử. Nhưng quan trọng hơn vẫn là thông qua các bước kỹ thuật cụ thể giúp người học nắm được những điểm cơ bản về nghiên cứu phát triển sinh học phân tử được các nhà nghiên cứu nhiều thế hệ sáng tạo và thực hiện trong quá khứ, và nhờ những kết quả nghiên cứu đó đ. vẽ lại bức tranh toàn cảnh về thế giới như đ. được khái quát hóa trong nhiều tài liệu sinh học.

Mong muốn của người biên soạn là người học nắm được những điểm cốt yếu của kỹ thuật sinh học phân tử rồi trên cơ sở đó phát triển những kỹ thuật hay cải tiến những bước cho phù hợp với thực tiễn nghiên cứu. Với những yêu cầu cao bao quát cả lịch sử phát triển lẫn cập nhật hóa kiến thức, việc biên soạn một giáo tr.nh thực hành về lĩnh vực này gặp rất nhiều khó khăn. Tuy vậy, chúng tôi cố gắng đưa vào tài liệu này những vấn đề liên quan đến thực hành sinh học phân tử chọn lọc từ những thành quả mà nhiều nhà nghiên cứu đ. mô tả trong nhiều bài báo chuyên ngành liên quan sinh học, một số thuyết tr.nh hướng dẫn của một số h.ng cung cấp thiết bị nghiên cứu sinh học cũng như từ kinh nghiệm cá nhân. Nhiều kỹ thuật và "thực đơn" cụ thể giới thiệu trong tài liệu này rất cũ nhằm giúp người học tránh những quan niệm đơn giản hóa con đường nghiên cứu khoa học. Những "thực đơn" mới liên quan được giới thiệu nhiều khi ở dưới dạng khái quát. Người học cần lưu . rằng hầu như tất cả những "thực đơn" đ. đưa ra đều là kết quả của kinh nghiệm nghiên cứu và suy luận khoa học của cá nhân trong quá tr.nh "tối ưu hóa". V. vậy, người làm thí nghiệm có thể cải tiến để có kết quả tốt hơn phù hợp điều kiện của m.nh. Khó khăn khác mà việc biên soạn gặp phải là yêu cầu dung lượng giáo tr.nh trong 30 tiết hạn chế số lượng trang in cũng như các kỹ thuật được chọn lọc. Để bù lại, học viên cần t.m nhiều nội dung bổ trợ trong các giáo tr.nh l. thuyết liên quan trong bộ sách này, như "Nhập môn sinh học phân tử", "Công nghệ sinh học", "Công nghệ DNA tái tổ hợp", "Công nghệ chuyển gen động vật, thực vật" và "Công nghệ protein"...

Trong thực tế, hai nhóm phương pháp nghiên cứu khoa học được song song vận dụng là các phương pháp thực nghiệm (experimentalistic) và các phương pháp tự nhiên học (naturalistic) hay quan sát tự nhiên, bổ sung cho nhau, và chúng ta không nên coi nhẹ cách thức nào. Tuy vậy, để tiếp cận với các quá tr.nh vi mô trong cơ thể sống th. việc quan sát tự nhiên, đo đạc các số liệu vĩ mô rồi từ đó khái quát thành l. luận về các quá tr.nh vi mô không c.n là con đường được đa số người lựa chọn. Nghiên cứu thực nghiệm đầy khó khăn về các quá tr.nh sinh học vi mô đ. trở thành cách thức chủ yếu để loài người nhận thức thế giới sinh học. Sinh học phân tử phát triển trên cơ sở kiến thức đa ngành. Có thể nói Sinh học phân tử là kết quả của sự phối hợp tư duy hóa học với phương tiện l. học và các hệ thống sinh học nhằm lặp lại các quá tr.nh sinh học tự nhiên để vận dụng trong sản xuất các sản phẩm con người mong muốn với hiệu suất cao hơn, cũng như phân loại các đối tượng sinh học và nhận biết chúng thông qua việc xác nhận phân tử đặc hiệu. Trong quá tr.nh này cần chú . rằng những hiện tượng ta quan sát được trong tự nhiên là kết quả tất nhiên của muôn vàn các chuyển hóa ngẫu nhiên. Do đó, những thực nghiệm nhằm lặp lại những hiện tượng tự nhiên đ. được h.nh thành qua hàng trăm triệu năm tiến hóa thường gặp không ít khó khăn. V. vậy, các kỹ thuật được giới thiệu cũng không thể tránh khỏi sự buồn tẻ của các thử nghiệm, tuyển chọn kết quả thử nghiệm, sàng lọc sản phẩm, dùng sản phẩm này làm nguyên liệu cho các thử nghiệm tiếp theo... Khi nào cũng vậy, chọn được cái sản phẩm đúng trong số cực kỳ lớn các sản phẩm gần đúng và các sản phẩm sai và sau đó nhân cái sản phẩm đúng duy nhất là các bước được ưu tiên trong kỹ thuật sinh học phân tử. Tuy kỳ vọng cao nhưng chúng tôi không tránh khỏi sai sót, rất mong được nhận sự góp . xây dựng của các đồng nghiệp và người đọc.

NỘI DUNG:

Chương 1. Những thao táccơ bản 3

I. Dụng cụ và hóa chất 3

1. Dụng cụ 3

2. Hóachất 4

2.1. Những điềuchú ý chung 4

2.2. Dung dịchgốc 5

II. Điện di 8

1. Điện di agarose 8

2. Điện di polyacrylamide 11

3. Thu hồi đoạnDNA từ gelđiện di 15

III. Chiếtsuất bằng phenol 19

1. Chế phenol 19

2. Chiếtxuất phenolvà chlorform 20

IV.Cô đặc và thẩmtích 21

1. Cô đặc 21

2. Thẩmtích 22

V.Phươngpháp định lượng acid nucleic(DNA và RNA) 24

1. Phương pháp quang học 24

2. Phương pháp địnhlượng bằngđiện di 24

3. Phương pháp nhỏ giọtđịnh lượngacidnucleic 25

Chương 2. Kỹ thuật cơbản trong táitổ hợp DNA 26

I. Điều chếDNA plasmid 26

1. Điều chếlượng nhỏ DNA plasmid 26

1.1.Phương pháp Birnboim 26

1.2. Phương pháp đun sôi 28

2. Điều chếlượng lớnDNA plasmid 28

2.1. Nuôicấyvikhuẩn 28

2.2. Chiếtxuất DNA 29

2.3. Điều chế plasmid bằng li tâm phân đoạn trong mật độ cesium

chloride(CsCl) 29

II. Điều chế DNA phage λ 32

1. Phương pháp xácđịnh hiệugiá phage 32

2. Điều chếlượng nhỏ DNA phage 32

1 6 6

2.1. Phương pháp điềuchế dịchphage dung khuẩn 33

2.2. Điều chếlượng nhỏ DNA phage 33

3. Điều chếlượng lớnDNA phage 34

3.1. Phương pháp chếdịch phagedung khuẩn 34

3.2. Điều chếDNA 35

III. Điều chế DNA tế bào động vật 37

IV.Phương pháp đánh dấu DNA 39

1. Phương pháp dịchkhấc (nick-translationmethod) 40

2. Phương pháp mồiđúp (multiprimemethod) 40

3. Đánh dấu đầu mút 41

3.1. Đánh dấu đầu 5' 41

3.2. Đánh dấu đầu 3' 41

4. Lọc gel 41

4.1. Sephadex 41

4.2. Phương pháp spin column(cộtli tâm)(bằngBio-Gel P-60) 42

5. Phương pháp đánh dấumẫudò bằngdigoxygenin 43

5.1. Đánh dấu bằng digoxygeninnhờphương pháp nhiềumồi 43

5.2. Đánh dấu bằng digoxygeninnhờPCR 44

V.Điều chếRNA 46

1. Phương pháp guanidinethiocyanate 46

2. Phương pháp phenolnóng 47

VI.Chế thư viện DNA bổ sung (cDNA liabrary) 49

1. Điều chếRNA-polyAnhờ cộtcellulosegắnd(T) 49

2. Phân đoạn nhờ litâmchênhlệch nồng độ saccharose 51

3. Tổng hợpcDNA 52

4. Sàng lọc (screening)thư việncDNA trong λgt10 nhờmẫudò

DNA tổng hợp 57

5. Sàng lọc (screening)thư việncDNA trong λgt10 nhờmẫudò

(probe) DNA đã dòng hóa 62

6. Sàng lọc thưviện cDNA trong λgt11 nhờmẫudò khángthể 63

VII.Tạo dòng thuần DNA bộ gen (DNA genome cloning) 66

1. Vector phage 67

2. Vector plasmidvà cosmid 71

VIII. Tạo tếbào khả biến hay chịu di nạp (competent cell) 75

1. Phương pháp CaCl2 75

2. Phương pháp Hanahan 76

3. Sử dụng tế bào khảbiến 77

IX. Subcloning(tái tạo dòng thuần) 78

1. Điều chếvector plasmid 78

2. Điều chếDNA cần gắn 78

1 6 7

X. Phân tíchđiều tiết phiên mãnhờ thử nghiệmCAT (CAT

assay) 81

1. Thí nghiệmchính:dinạp gen vào tếbào eukaryota 81

2. CATassay 82

Chương 3. Kỹ thuật phân tíchxácnhận phân tử 84

I. Kỹ thuật laiSouthern (Southern hybridization) 84

1. ChuyểnSouthern (Southerntransfer) 84

2. Lai(hybridization) 86

3. Laigel khô 87

II. Lai Northern (Northern hybridization) và lai thẩm đốm (dot

blot hybridization) 90

1. Northernhybridization (biến tínhRNA bằngformaldehyde) 90

2. Dotblot hybridization (sử dụng hydroxymethyl thủyngân) 91

III. Phương pháp xácđịnh trình tự nucleotidecủa DNA 93

1. Phương pháp dideoxy 94

1.1. Điều chếDNA khuôn 95

1.2. Điều chếdung dịch nucleotidecho phản ứng dideoxy 97

1.3. Gắn kết DNA khuôn vớimồi 98

1.4. Phản ứng dideoxy 99

1.5. Sequencinggel (gelgiảitrình) 101

1.6. Sequencing DNA với máy luân nhiệt và DNA-Sequencer tự

động 103

2. Phương pháp Maxam-Gilbert 106

2.1. Đánh dấu hóa học 107

2.2. Phân giảibằng piperidinevàđiện ditrong gel 108

3. Phương pháp xác định trình tự nucleotide nằm kề đoạn DNA đã

biết 109

IV.Phương pháp mapping và nối dài mồi (primer) 110

1. S1 mapping 110

2. Phương pháp nốidài mồi 111

2.1. Phương pháp sử dụng DNA hai sợi 111

2.2. Phương pháp sử dụng primertổng hợp 112

3. Mapping bằng riboprobe(riboprobe mapping) 113

V.Hệphiên mã in vitro 115

1. Phương pháp điềuchế dịchchiếtthô tếbào HeLa 115

1.1. Dịch chiếtxuấttoàn tếbào 115

1.2. Dịch chiếtxuấtS-100 116

1.3. Dịch chiếtxuấtnhân 117

2. Phiên mã in vitro(run-off assay) 118

2.1. Sử dụng promotercủarDNA của ngườivớipol I 118

1 6 8

2.2. Sử dụng hệ pol II vớipromotermajorlateAd 2 119

2.3. Điện di tronggel agarose 119

VI.Thử nghiệmrun-on nhân 121

1. Phân li nhân 121

2. Thẩmđốmlênmàng 121

3. Điều chếRNA tổ chức 122

4. Hybridization 123

VII.Phân tích xêdịch gel(gel shift analysis) 125

VIII. Thí nghiệm cản trở kết hợp methyl hóa dimethyl sulfate

(DMS) 127

IX. Phương pháp "vết chân" (foot print) nhờDNase I 128

X. Phân tíchprotein 130

1. Định lượngprotein (phươngpháp Bradford) 130

1.1. Điều chếcác hóachất 130

1.2. Định lượng 130

2. Điện di SDS-polyacrylamide 130

2.1. Chế tácgel SDS-polyacrylamide 131

2.2. Điều chếmẫu,điệndi và nhuộm 131

3. Phương pháp thẩmWestern 133

3.1. Blotting 133

3.2. Nhuộmbằng kháng thể 134

XI. Tinh chế protein kết hợp DNA nhờ sử dụng trình tự DNA

đặc hiệu 136

1. Điều chếDNA 136

2. Kết hợp DNA vớisepharose đãđược hoạthóa bởiCNBr 137

3. Tinh chế protein bằng cột Sepharose đã kết hợp DNA có trình

tự base đặc hiệu 138

XII. South-Western hybridazation 139

1. Điều chế dịch chiếtxuất tếbào 139

2. Phương pháp South-Westernblot(thẩmSouth-Western) 140

XIII. Phươngpháp tạo thể đột biến nhân tạo 141

1. Chế tácthể độtbiến khuyếttổn 141

1.1. Tiêuhóa từng phầnbằng Bal31 142

1.2. Tạo dòng phụ (subcloning)đoạn khuyếttổn 143

2. Chế tácthể độtbiến vịtrí chỉđịnh 144

2.1. Phương pháp sử dụng DNA tổng hợplàmmồi 144

2.2. Phương pháp sử dụng DNA tổng hợp như đoạn ghép (phương

pháp biếndị cassette) 149

XIV.PCR 151

1. PCR 151

1 6 9

2. Mộtsố kỹthuậtmởrộng áp dụng PCR 153

XV.Phương pháp "vân tay" DNA (DNA finger print) 157

1. Phương pháp DNA fingerprint 157

2. Phương pháp mẫudò lạnh (coldprobe) 158

Tài liệuthamkhảo 162

Mục lục

LINK DOWNLOAD

NỘI DUNG: