%20(1)%20(1).png)
Ứng dụng quy trình PCR để phát hiện virus gây bệnh laem singh (LSNV) trên tôm sú ở tỉnh khánh hòa
.png)
Nuôi tôm thâm canh hiện đang phát triển nhanh chóng và ngày càng mang lại nhiều lợi nhuận cho nhiều nước trên thế giới. Trong đó tôm sú (P. monodon) là loài quan trọng được nuôi tại Việt Nam từ hơn 30 năm qua. Trong nhiều năm loài này được xem là giống chính đưa Việt Nam vào danh sách những nước cung cấp tôm quan trọng của thế giới. Mặc dù vậy, rủi ro cho nghề nuôi tôm cũng không nhỏ, dịch bệnh hiện đang là một trở ngại lớn trong sự phát triển ngành nuôi tôm công nghiệp ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung. Dịch bệnh do virus là một trong những nguyên nhân gây nguy hiểm cho môi trường biển. Người ta ước tính rằng khoảng 60% thiệt hại kinh tế ở tôm nuôi trồng thủy sản đã được gây ra bởi các mầm bệnh virus và 20% bởi các mầm bệnh vi khuẩn. Có nhiều loài virus được tìm thấy trên tôm nuôi đặc biệt là trên tôm sú (P. monodon) như GAV, YHV, MBV, HPV Laem singh virus (LSNV) là loại virus mới được phát hiện gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi tôm công nghiệp. Tôm sú nhiễm bệnh này thường không thể hiện rõ biểu hiện bệnh hoặc có sự chậm lớn nên thường kéo dài vụ nuôi và kích thước tôm nuôi làm giảm năng suất và giá trị tôm sú nuôi. LSNV có mặt ở tất cả các giai đoạn sản xuất từ tôm sú bố mẹ, tôm giống và tôm nuôi thương phẩm với tỷ lệ cao ở Việt Nam. Do chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là rất cần thiết. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như mô bệnh học hay dựa trên kinh nghiệm của người nuôi không cho phép phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh.
Nhiều phương pháp như lai in situ, kính hiển vi điện tử TEM, PCR, RT-PCR được phát triển nhằm khắc phục những nhược điểm vừa kể trong việc phát hiện LSNV trên tôm sú giúp người nuôi phát hiện kịp thời, hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do dịch bệnh gây ra, nâng cao năng suất.
Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Ứng dụng quy trình PCR để phát hiện virus gây bệnh Laem singh (LSNV) trên tôm sú ở tỉnh Khánh Hòa”.
Đề tài này nhằm thực hiện các mục tiêu chính sau đây:
- Ứng dụng quy trình PCR chuẩn phát hiện LSNV trên tôm sú nghi ngờ nhiễm bệnh.
- Khảo sát sự hiện diện của virus Laem singh virus trên tôm sú khu vực tỉnh Khánh Hòa.
NỘI DUNG:
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. TÌNH HÌNH NUÔI TÔM, DỊCH BỆNH VÀ NGHIÊN CỨU 2
1.1.1. Trên thế giới 2
1.1.2. Tại Việt Nam 4
1.2. VIRUS GÂY HỘI CHỨNG CHẬM LỚN (LSNV) 9
1.2.1. Hình thái, Cấu trúc 9
1.2.2. Cơ chế xâm nhiễm 11
1.2.3. Cách thức lan truyền 11
1.2.4. Dấu hiệu tôm nhiễm bệnh 11
1.2.5. Sự nhạy cảm của các loài tôm với LSNV 12
1.2.6. Mô mục tiêu 13
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN LSNV TRÊN TÔM 13
1.3.1. Phương pháp mô bệnh học 13
1.3.2. Phương pháp lai tại chỗ 14
1.3.3. Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua 15
1.3.4. Phương pháp PCR 15
1.3.4.1. Chương trình PCR 16
1.3.4.2. Các thành phần và ảnh hưởng của chúng tới hiệu quả của phản ứng PCR.17
1.3.5. Phương pháp RT-PCR 20
1.4. TÍNH CẤP THIẾT VÀ MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 21
1.4.1. Tính cấp thiết 21
1.4.2. Mục tiêu của đề tài 21
ii
Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. VẬT LIỆU 22
2.1.1. Mẫu thí nghiệm 22
2.1.2. Cặp mồi cho phản ứng PCR 22
2.1.3. Hóa chất 23
2.2.4. Thiết bị chuyên dụng 24
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.3.1. Thu và chuẩn bị mẫu 25
2.3.2. Tách chiết RNA tổng số 25
2.3.2.1. Nguyên tắc 25
2.3.2.2. Phương pháp tiến hành 25
2.3.3. Nhân gen bằng kỹ thuật RT- PCR 26
2.3.3.1. Thiết lập điều kiện phản ứng 26
2.3.3.2. Thí nghiệm tối ưu nhiệt độ lai 28
2.3.3.3. Tính đặc hiệu của phương pháp 28
2.3.3.4. Giới hạn phát hiện của phương pháp (độ nhạy của quy trình) 29
2.2.4. Điện di trên gel agarose 29
2.2.4.1. Nguyên tắc 29
2.2.4.2. Phương pháp tiến hành 29
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. QUY TRÌNH RT-PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH LSNV 31
3.1.1. Các đặc tính của mồi trên lý thuyết 31
3.1.1.1. Các thông số của mồi 31
3.2.1.2. Tính đặc hiệu của mồi 34
3.2.2. Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế và các điều kiện của phản ứng
PCR 35
3.2.2.1. Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế 35
3.2.2. Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu 36
iii
3.2.3. Xác định tính đặc hiệu 38
3.2.4. Giới hạn phát hiện của phương pháp 39
3.3. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH RT-PCR TRÊN MẪU TÔM SÚ KHU VỰC TỈNH
KHÁNH HÒA 42
3.3.1. Tỷ lệ tôm sú nhiễm LSNV theo mùa thu mẫu 44
3.3.2. Tỷ lệ tôm sú nhiễm LSNV theo khu vực thu mẫu 45
3.3.3. Tỷ lệ tôm sú nhiễm LSNV theo loại mẫu 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51
Nuôi tôm thâm canh hiện đang phát triển nhanh chóng và ngày càng mang lại nhiều lợi nhuận cho nhiều nước trên thế giới. Trong đó tôm sú (P. monodon) là loài quan trọng được nuôi tại Việt Nam từ hơn 30 năm qua. Trong nhiều năm loài này được xem là giống chính đưa Việt Nam vào danh sách những nước cung cấp tôm quan trọng của thế giới. Mặc dù vậy, rủi ro cho nghề nuôi tôm cũng không nhỏ, dịch bệnh hiện đang là một trở ngại lớn trong sự phát triển ngành nuôi tôm công nghiệp ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung. Dịch bệnh do virus là một trong những nguyên nhân gây nguy hiểm cho môi trường biển. Người ta ước tính rằng khoảng 60% thiệt hại kinh tế ở tôm nuôi trồng thủy sản đã được gây ra bởi các mầm bệnh virus và 20% bởi các mầm bệnh vi khuẩn. Có nhiều loài virus được tìm thấy trên tôm nuôi đặc biệt là trên tôm sú (P. monodon) như GAV, YHV, MBV, HPV Laem singh virus (LSNV) là loại virus mới được phát hiện gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi tôm công nghiệp. Tôm sú nhiễm bệnh này thường không thể hiện rõ biểu hiện bệnh hoặc có sự chậm lớn nên thường kéo dài vụ nuôi và kích thước tôm nuôi làm giảm năng suất và giá trị tôm sú nuôi. LSNV có mặt ở tất cả các giai đoạn sản xuất từ tôm sú bố mẹ, tôm giống và tôm nuôi thương phẩm với tỷ lệ cao ở Việt Nam. Do chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là rất cần thiết. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như mô bệnh học hay dựa trên kinh nghiệm của người nuôi không cho phép phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh.
Nhiều phương pháp như lai in situ, kính hiển vi điện tử TEM, PCR, RT-PCR được phát triển nhằm khắc phục những nhược điểm vừa kể trong việc phát hiện LSNV trên tôm sú giúp người nuôi phát hiện kịp thời, hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do dịch bệnh gây ra, nâng cao năng suất.
Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Ứng dụng quy trình PCR để phát hiện virus gây bệnh Laem singh (LSNV) trên tôm sú ở tỉnh Khánh Hòa”.
Đề tài này nhằm thực hiện các mục tiêu chính sau đây:
- Ứng dụng quy trình PCR chuẩn phát hiện LSNV trên tôm sú nghi ngờ nhiễm bệnh.
- Khảo sát sự hiện diện của virus Laem singh virus trên tôm sú khu vực tỉnh Khánh Hòa.
NỘI DUNG:
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. TÌNH HÌNH NUÔI TÔM, DỊCH BỆNH VÀ NGHIÊN CỨU 2
1.1.1. Trên thế giới 2
1.1.2. Tại Việt Nam 4
1.2. VIRUS GÂY HỘI CHỨNG CHẬM LỚN (LSNV) 9
1.2.1. Hình thái, Cấu trúc 9
1.2.2. Cơ chế xâm nhiễm 11
1.2.3. Cách thức lan truyền 11
1.2.4. Dấu hiệu tôm nhiễm bệnh 11
1.2.5. Sự nhạy cảm của các loài tôm với LSNV 12
1.2.6. Mô mục tiêu 13
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN LSNV TRÊN TÔM 13
1.3.1. Phương pháp mô bệnh học 13
1.3.2. Phương pháp lai tại chỗ 14
1.3.3. Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua 15
1.3.4. Phương pháp PCR 15
1.3.4.1. Chương trình PCR 16
1.3.4.2. Các thành phần và ảnh hưởng của chúng tới hiệu quả của phản ứng PCR.17
1.3.5. Phương pháp RT-PCR 20
1.4. TÍNH CẤP THIẾT VÀ MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 21
1.4.1. Tính cấp thiết 21
1.4.2. Mục tiêu của đề tài 21
ii
Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. VẬT LIỆU 22
2.1.1. Mẫu thí nghiệm 22
2.1.2. Cặp mồi cho phản ứng PCR 22
2.1.3. Hóa chất 23
2.2.4. Thiết bị chuyên dụng 24
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.3.1. Thu và chuẩn bị mẫu 25
2.3.2. Tách chiết RNA tổng số 25
2.3.2.1. Nguyên tắc 25
2.3.2.2. Phương pháp tiến hành 25
2.3.3. Nhân gen bằng kỹ thuật RT- PCR 26
2.3.3.1. Thiết lập điều kiện phản ứng 26
2.3.3.2. Thí nghiệm tối ưu nhiệt độ lai 28
2.3.3.3. Tính đặc hiệu của phương pháp 28
2.3.3.4. Giới hạn phát hiện của phương pháp (độ nhạy của quy trình) 29
2.2.4. Điện di trên gel agarose 29
2.2.4.1. Nguyên tắc 29
2.2.4.2. Phương pháp tiến hành 29
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. QUY TRÌNH RT-PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH LSNV 31
3.1.1. Các đặc tính của mồi trên lý thuyết 31
3.1.1.1. Các thông số của mồi 31
3.2.1.2. Tính đặc hiệu của mồi 34
3.2.2. Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế và các điều kiện của phản ứng
PCR 35
3.2.2.1. Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế 35
3.2.2. Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu 36
iii
3.2.3. Xác định tính đặc hiệu 38
3.2.4. Giới hạn phát hiện của phương pháp 39
3.3. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH RT-PCR TRÊN MẪU TÔM SÚ KHU VỰC TỈNH
KHÁNH HÒA 42
3.3.1. Tỷ lệ tôm sú nhiễm LSNV theo mùa thu mẫu 44
3.3.2. Tỷ lệ tôm sú nhiễm LSNV theo khu vực thu mẫu 45
3.3.3. Tỷ lệ tôm sú nhiễm LSNV theo loại mẫu 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51
.png "Hướng dẫn download ti liệu")
%20(1).png "Hướng dẫn download ti liệu")
%20(1).png "Gói VIP Member EBOOKBKMT - Hỗ trợ tài liệu nhanh nhất, ưu tiên cho thành viên VIP (Update 2026)")
.png "SÁCH - Cẩm nang thợ điện học - Từ phổ thông tới thợ điện (Nguyễn Văn Phong) Full")
.png "QUYẾT ĐỊNH 438:QĐ-CT - Ban hành Quy chế giáo dục chính trị trong Quân đội nhân dân và Dân quân tự vệ Việt Nam (Full)")
%20(1).png "SÁCH - Tính toán và thiết kế hệ thống sấy (Trần Văn Phú) Full")
.png "SÁCH - Cơ sở thiết kế máy & chi tiết máy (Trịnh Chất) Full")
Không có nhận xét nào: