Phát hiện vi khuẩn salmonella bằng phương pháp realtime PCR

Xuất phát từ thực tế trên đề tài “Phát hiện vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp Realtime PCR” được tiến hành với các mục tiêu chính sau:

 Phân lập các chủng Salmonella có mặt trong một số mẫu thực phẩm thu mua tại các cơ sở chế biến thủy sản và các chợ ở Thành phố Nha Trang và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn này bằng các thử nghiệm sinh hóa.

 Xác định gen độc tố invA của vi khuẩn Salmonella bằng kỹ thuật Realtime PCR và so sánh kết quả với kỹ thuật PCR phát hiện Salmonella, tạo cơ sở khoa học cho việc phát hiện và điều trị bệnh sớm.

 Xây dựng đường chuẩn của phương pháp Realtime PCR từ đó có thể định lượng chính xác số bản sao DNA ban đầu có trong mẫu phân tích và suy ra lượng vi khuẩn có trong mẫu thực phẩm.

NỘI DUNG:

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... iv

DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... v

DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... vi

LỜI NÓI ĐẦU ........................................................................................................ 1

Chương 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 3

1.1. Tổng quan về vi khuẩn Salmonella ................................................................ 3

1.1.1. Phân loại Salmonella ..................................................................................... 3

1.2.2. Các đặc điểm sinh học của Salmonella........................................................... 4

1.2.3. Kháng nguyên của Salmonella ....................................................................... 7

1.2.4. Khả năng và cơ chế gây bệnh của Salmonella ................................................ 9

1.2.5. Gen độc tố invA của Salmonella................................................................... 11

1.2.Tình hình ngộ độc thực phẩm do Salmonella gây ra .................................... 14

1.2.1.Trên thế giới ................................................................................................. 14

1.2.2. Ở Việt Nam ................................................................................................. 15

1.3. Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Salmonella ................................ 16

1.3.1. Phương pháp PCR ....................................................................................... 17

1.3.2. Phương pháp Realtime PCR ........................................................................ 19

1.4. Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài ........................................................... 22

1.4.1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................... 22

1.4.2. Mục tiêu của đề tài ....................................................................................... 22

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 24

2.1. Vật liệu .......................................................................................................... 24

2.1.1. Mẫu ............................................................................................................. 24

2.1.2. Thiết bị chuyên dụng ................................................................................... 24

2.1.3. Hóa chất, môi trường và thuốc thử ............................................................... 24

2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 30

2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 31

iii

GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà

2.3.1. Phân lập và nuôi cấy Salmonella .................................................................. 31

2.3.2. Nhuộm Gram ............................................................................................... 34

2.3.3. Tách chiết DNA với bộ kít Wizard® SV Genomic DNA Purification System

.............................................................................................................................. 35

2.3.4. Xác định nồng độ DNA bằng điện di gel agarose và đo OD ......................... 36

2.3.5. Xây dựng quy trình PCR phát hiện Salmonella ............................................ 38

2.3.6. Xây dựng quy trình Realtime PCR phát hiện Salmonella ............................. 40

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 43

3.1. Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Salmonella .................................................. 43

3.2. Xác định hình thái tế bào vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram ...... 46

3.3. Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn .............................................. 47

3.3.1. Khả năng sử dụng các loại đường của các chủng Salmonella ....................... 47

3.3.2. Khả năng sử dụng lysin của các chủng Salmonella ...................................... 50

3.4. Tách chiết DNA tổng số ................................................................................ 51

3.5. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen invA....................................................... 52

3.5.1. Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen invA ..................... 52

3.5.2. Kết quả chạy PCR khảo sát nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi invA1,2 ................ 53

3.5.3. Kết quả khảo sát nồng độ mồi invA1,2 ......................................................... 55

3.5.4. Khảo sát độ nhạy của phản ứng PCR ........................................................... 56

3.6. Phản ứng Realtime PCR khuếch đại đoạn gen invA ................................... 57

3.6.1. Kết quả thử nghiệm phản ứng Realtime PCR phát hiện Salmonella .............57

36.2. Khảo sát độ nhạy của phản ứng Realtime PCR ............................................. 58

3.6.3. Kết quả phân tích nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm khuếch đại................... 60

3.6.4. Kết quả xây dựng đường chuẩn Realtime PCR phát hiện Salmonella ........... 62

Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..

LINK DOWNLOAD

Xuất phát từ thực tế trên đề tài “Phát hiện vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp Realtime PCR” được tiến hành với các mục tiêu chính sau:

NỘI DUNG: