Nghiên cứu nhân giống cây chanh dây (Passiflora edulis) bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào và thử nghiệm tạo cây vi ghép

Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào (kỹ thuật nuôi cấy TCL) là kỹ thuật nuôi cấy những mẫu có kích thước nhỏ được cắt ra từ các cơ quan thực vật khác nhau. Khi mẫu được phân tách theo chiều dọc được gọi là lTCL (longitudinal TCL) hoặc khi mẫu được phân tách theo chiều ngang được gọi là tTCL (transverse TCL) [154].

Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm: mẫu tiếp xúc trực tiếp với môi trường và diện tích tiếp xúc lớn; lượng hormone nội sinh trong mẫu thấp; mẫu nuôi cấy đồng nhất và đáp ứng nhanh với điều kiện môi trường; phôi và các cơ quan sơ khởi được hình thành ở tần số cao, tiềm năng tái sinh cao; tạo ra giống cây trồng hoàn chỉnh, ít biến dị; nhanh chóng đạt kết quả trong thời gian ngắn,… Chính những ưu điểm trên mà kỹ thuật này được áp dụng thành công cho sự phát sinh phôi vô tính và tái sinh chồi ở nhiều loài cây hai lá mầm và cây một lá mầm, bao gồm một vài giống Lan và các giống cây trồng khác như Dendrobium aqueum [121], cây sâm Ngọc Linh [112]. Nó cũng được ứng dụng thành công trong tái sinh một số cây thân gỗ bao gồm cọ dầu,

táo,… [137], [47]. Ngoài ra, kỹ thuật này còn đạt tỷ lệ thành công cao trên những đối tượng được xem là khó nuôi cấy như cây lúa mì, cây tre, cây thông [114], [115].

Vi ghép là một kỹ thuật được sử dụng trong vi nhân giống để cải thiện chất lượng, gia tăng năng suất cây giống và nhân nhanh giống đặc biệt là cây ăn quả. Bởi kỹ thuật này có tiềm năng kết hợp giữa đặc điểm di truyền của cành ghép với đặc tính kháng bệnh, khả năng thích nghi môi trường của gốc ghép; và với các ưu điểm của nhân nhanh trong ống nghiệm. Mặt khác, kỹ thuật vi ghép góp phần tạo ra những cây giống hoàn toàn sạch bệnh được ứng dụng cho sản xuất đại trà. Vì vậy, những quy trình vi ghép thành công đã được phát triển cho các loại cây ăn quả khác nhau bao gồm hạch nhân, táo, nho, dâu tằm, cam quýt,… [74].

Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài: “Nghiên cứu nhân giống cây chanh dây (Passiflora edulis) bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào và thử nghiệm tạo cây vi ghép” được thực hiện.

NỘI DUNG:

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 5

1.1. SƠ LƢỢC VỀ CÂY CHANH DÂY ........................................................ 5

1.1.1. Phân loại, nguồn gốc và phân bố ............................................................. 5

1.1.2. Hình thái và đặc tính sinh học cây chanh dây .......................................... 5

1.1.3. Một số virus gây bệnh thƣờng gặp ở chanh dây ..................................... 6

1.1.4. Các thành phần dinh dƣỡng trong quả chanh dây ................................... 7

1.1.5. Giá trị kinh tế ......................................................................................... 8

1.1.6. Tình hình trồng chanh dây ở Lâm Đồng .................................................. 8

1.1.7. Các phƣơng pháp nhân giống chanh dây ................................................. 8

1.1.7.1. Phương pháp truyền thống ........................................................... 8

1.1.7.2. Phương pháp vi nhân giống ......................................................... 10

1.1.8. Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh .................................................................... 13

1.1.9. Kỹ thuật vi ghép ...................................................................................... 15

1.2. KỸ THUẬT NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO .................................... 16

1.2.1. Giới thiệu chung ....................................................................................... 16

1.2.2. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy TCL ............................................................ 18

1.2.2.1. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy TCL trên cây ăn quả và cây thân

gỗ .................................................................................................. 18

1.2.2.2. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy TCL trên cây dược liệu ................... 21

1.3. ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG TÁI

SINH, SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA THỰC VẬT ............. 22

1.3.1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy .......................................................................... 22

vii

1.3.1.1. Kiểu gen........................................................................................ 22

1.3.1.2. Vị trí và loại của mẫu cấy ............................................................ 23

1.3.2. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng thực vật ................................. 24

1.3.3. Ảnh hƣởng của ánh sáng .......................................................................... 26

1.3.4. Ảnh hƣởng của AgNO3

và nano bạc (AgNPs) ........................................ 26

1.3.4.1. AgNO

3

........................................................................................... 26

1.3.4.2. AgNPs ........................................................................................... 27

1.3.5. Ảnh hƣởng của giá thể ............................................................................. 29

1.3.6. Ảnh hƣởng của môi trƣờng khoáng ......................................................... 30

1.3.7. Sự thoáng khí và nồng độ CO2

, O2

.......................................................... 31

Chƣơng 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 33

2.1. VẬT LIỆU ............................................................................................... 33

2.1.1. Vật liệu thực vật ....................................................................................... 33

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ................................................................... 33

2.1.3. Thiết bị chiếu sáng ................................................................................... 33

2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy ................................................................................. 34

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................................... 34

2.2.1. Nghiên cứu vi nhân giống cây chanh dây tím và vàng thông qua kỹ

thuật nuôi cấy TCL ................................................................................................ 34

2.2.2. Nghiên cứu tạo cây chanh dây lai sinh dƣỡng giữa giống chanh dây tím

và vàng bằng kỹ thuật vi ghép............................................................................... 35

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................... 35

2.3.1. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm................................................................. 35

2.3.1.1. Thí nghiệm 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và

nguồn mẫu lên sự tái sinh chồi in vitro giống chanh dây tím và vàng ........ 35

2.3.1.2. Thí nghiệm 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA riêng lẻ, kết hợp

NAA lên khả năng tái sinh chồi từ TCL lá giống chanh dây tím và vàng ... 36

2.3.1.3. Thí nghiệm 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA riêng lẻ, kết hợp

NAA lên khả năng tái sinh chồi từ TCL đoạn thân giống chanh dây tím và

vàng .............................................................................................................. 37

viii

2.3.1.4. Thí nghiệm 4. Nghiên cứu ảnh hưởng vị trí của mẫu TCL lên

khả năng tái sinh chồi giống chanh dây tím và vàng .................................. 38

2.3.1.5. Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể lên khả năng

tái sinh chồi từ mẫu TCL giống chanh dây tím và vàng .............................. 38

2.3.1.6. Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng

khác nhau lên khả năng tái sinh chồi từ mẫu TCL giống chanh dây tím và

vàng ...... ....................................................................................................... 39

2.3.1.7. Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNO

3

, AgNPs lên

khả năng tái sinh chồi từ mẫu TCL giống chanh dây tím và vàng ............... 39

2.3.1.8. Thí nghiệm 8. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường khoáng

lên sự nhân nhanh chồi (có nguồn gốc TCL) giống chanh dây tím và vàng 39

2.3.1.9. Thí nghiệm 9. Nghiên cứu ảnh hưởng của cytokinin (BA kết hợp

Kin) lên sự nhân nhanh chồi (có nguồn gốc TCL) giống chanh dây tím và

vàng .............................................................................................................. 40

2.3.1.10. Thí nghiệm 10. Nghiên cứu ảnh hưởng của bình nuôi cấy thoáng

khí và không thoáng khí lên sự nhân nhanh chồi (có nguồn gốc TCL)

giống chanh dây tím và vàng ........................................................................ 40

2.3.1.11. Thí nghiệm 11. Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin (NAA, IBA)

lên khả năng hình thành rễ của chồi in vitro (có nguồn gốc TCL) và sinh

trưởng ngoài vườn ươm của giống chanh dây tím và vàng ......................... 41

2.3.1.12. Thí nghiệm 12. Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng LED lên

chất lượng cây con in vitro (có nguồn gốc TCL) và sinh trưởng ngoài

vườn ươm của giống chanh dây tím và vàng................................................ 41

2.3.1.13. Thí nghiệm 13. Tạo nguồn vật liệu chồi thông qua nuôi cấy mô

phân sinh đỉnh .............................................................................................. 41

2.3.1.14. Thí nghiệm 14. Vi ghép giống chanh dây tím và vàng có nguồn

gốc từ nuôi cấy mô phân sinh đỉnh ............................................................... 42

2.3.1.15. Trồng thử nghiệm giống chanh dây vi ghép ngoài vườn ươm và

đồng ruộng.................................................................................................... 43

2.3.2. Một số công thức tính khi thu nhận số liệu .............................................. 43

2.3.3. Phƣơng pháp xử lý thống kê .................................................................... 44

2.3.4. Phƣơng pháp giải phẫu hình thái ............................................................. 44

ix

2.3.5. Phƣơng pháp kiểm tra virus dựa trên kỹ thuật Reverse transcriptasePCR (RT-PCR) ...................................................................................................... 44

2.3.5.1. Thu mẫu và tách chiếc ribonucleic acid (RNA) tổng số .............. 44

2.3.5.2. Kiểm tra virus dựa trên kỹ thuật RT-PCR .................................... 45

2.4. ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ......................................................................... 45

2.4.1. Điều kiện nuôi cấy in vitro ....................................................................... 45

2.4.2. Điều kiện nuôi cấy ngoài vƣờn ƣơm ........................................................ 46

2.4.3. Điều kiện trồng và chăm sóc ngoài đồng ruộng ...................................... 47

2.4.3.1. Chuẩn bị đất trồng ....................................................................... 47

2.4.3.2. Kỹ thuật làm giàn ......................................................................... 47

2.4.3.3. Kỹ thuật chăm sóc và bón phân ................................................... 47

2.5. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI .............................. 49

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................. 50

3.1. VI NHÂN GIỐNG CHANH DÂY TÍM VÀ VÀNG THÔNG QUA KỸ

THUẬT NUÔI CẤY TCL .................................................................................... 50

3.1.1. Tạo nguồn vật liệu in vitro dƣới ảnh hƣởng của điều kiện khử trùng và

nguồn mẫu ............................................................................................................. 50

3.1.2. Tái sinh chồi in vitro ................................................................................ 57

3.1.2.1. Ảnh hưởng của BA riêng lẻ, kết hợp NAA lên khả năng tái sinh

chồi từ tTCL-L và lTCL-L ............................................................................ 57

3.1.2.2. Ảnh hưởng của BA riêng lẻ, kết hợp NAA lên khả năng tái sinh

chồi từ tTCL-T và lTCL-T ............................................................................ 60

3.1.2.3. So sánh hiệu quả tái sinh chồi từ các nguồn mẫu TCL ................ 67

3.1.2.4. Ảnh hưởng vị trí của mẫu .............................................................. 69

3.1.2.5. Ảnh hưởng của giá thể .................................................................. 71

3.1.2.6. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng ............................................ 74

3.1.2.7. Ảnh hưởng của AgNO

3

, AgNPs ..................................................... 79

3.1.3. Nhân nhanh chồi ...................................................................................... 83

3.1.3.1. Ảnh hưởng của môi trường khoáng .............................................. 83

3.1.3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp Kin ..................................................... 86

3.1.3.3. Ảnh hưởng của bình nuôi cấy thoáng khí và không thoáng khí .... 90

3.1.4. Sự hình thành rễ và cải thiện chất lƣợng cây con in vitro ....................... 93

3.1.4.1. Ảnh hưởng của NAA, IBA lên khả năng hình thành rễ in vitro .... 93

3.1.4.2. Ảnh hưởng của ánh sáng LED lên chất lượng cây con in vitro .... 103

x

3.2. TẠO CÂY CHANH DÂY LAI SINH DƢỠNG GIỮA GIỐNG

CHANH DÂY TÍM VÀ VÀNG BẰNG KỸ THUẬT VI GHÉP ......................... 113

3.2.1. Tạo nguồn vật liệu in vitro thông qua nuôi cấy mô phân sinh đỉnh ........ 113

3.2.2. Tái sinh và nhân nhanh chồi (chồi có nguồn gốc từ nuôi cấy mô phân

sinh đỉnh) thông qua kỹ thuật nuôi cấy TCL ........................................................ 119

3.2.3. Vi ghép ..................................................................................................... 121

3.2.4. Thích nghi, sinh trƣởng của cây chanh dây vi ghép ở điều kiện vƣờn

ƣơm và trồng thử nghiệm ngoài đồng ruộng ......................................................... 124

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................... 129

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ...................................................................... 131

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 132

PHỤ LỤC

LINK DOWNLOAD

NỘI DUNG: