Tạo và khảo sát hoạt tính sinh học in vitro của thụ thể interleukin 33 dạng tự do được biểu hiện từ tế bào người hek293

Nội dung nghiên cứu bao gồm:

1. Tạo dòng plasmid pmsIL33R-Fc mang gen mã hóa protein msIL-33R:Fc hIgG1

2. Biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 từ tế bào người HEK293

3. Phân tích một số đặc điểm của protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1

4. Biểu hiện IL-33 chuột có đánh dấu biotin (bio-mIL33) từ vi khuẩn E.coli

5. Khảo sát sự tương tác của msIL-33R:Fc hIgG1 với bio-mIL33 trong điều kiện in vitro

6. Khảo sát sự cạnh tranh của msIL-33R:Fc hIgG1 với IL-33R biểu hiện ở bề mặt tế bào trong việc tương tác với bio-mIL33

7. Đánh giá khả năng ức chế hoạt động IL-33 của msIL-33R:Fc hIgG1 trên mô hình tế bào EL-4 nuôi cấy in vitro

Phần tổng quan tài liệu sẽ tóm tắt các hiểu biết hiện nay về hệ IL-33/IL-33R và một số vấn đề có liên quan đến đề tài nghiên cứu.

NỘI DUNG:

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 2

1.1. Vai trò của IL-33 trong sinh lý và bệnh lý .................................................. 2

1.1.1. Vai trò của IL-33 trong sinh lý ............................................................ 2

1.1.2. Vai trò của IL-33 trong bệnh lý ........................................................... 3

1.2. Đặc điểm sinh học của IL-33 ...................................................................... 6

1.2.1. Cấu trúc của IL-33 ............................................................................ 6

1.2.2. Tế bào sinh tổng hợp và tế bào đích của IL-33 .................................. 7

1.2.3. IL-33 ngoại bào và nội bào ................................................................ 8

1.2.4. Con đường truyền tín hiệu của IL-33 thông qua IL-33R .................... 9

1.3. Đặc điểm sinh học của IL-33R ................................................................. 10

1.3.1. Cấu trúc của IL-33R ........................................................................ 10

1.3.2. Tương tác của IL-33 với IL-33R ..................................................... 11

1.3.3. IL-33R dạng tự do ........................................................................... 12

1.4. Ức chế hoạt động của IL-33 là một liệu pháp tìềm năng điều trị

các bệnh viêm – dị ứng ............................................................................. 12

1.5. Sơ lược về các dược phẩm ức chế hoạt động cytokine dựa trên nguyên tắc

tương tác cạnh tranh .................................................................................. 14

1.6. Hệ thống tế bào động vật biểu hiện protein tái tổ hợp ............................... 16

CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................. 18

2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 18

2.1.1. Plasmid ............................................................................................. 18

iii

2.1.2. Hóa chất tạo dòng plasmid biểu hiện msIL-33R:Fc hIgG1 ................ 19

2.1.3. Hóa chất dùng trong nuôi cấy vi khuẩn E. coli................................... 19

2.1.4. Hóa chất nuôi cấy tế bào HEK293 và EL-4 ....................................... 19

2.1.5. Hóa chất dùng để biến nạp plasmid vào E.coli và HEK293 ............... 20

2.1.6. Hóa chất li giải tế bào, định lượng protein và thủy phân

nhóm đường trên glycoprotein ........................................................... 20

2.1.7. Hóa chất dùng cho SDS-PAGE, Western Blot và

đồng kết tủa miễn dịch ...................................................................... 20

2.1.8. Hóa chất ELISA ................................................................................ 21

2.2. Phương pháp ............................................................................................ 22

2.2.1. Tạo plasmid biểu hiện protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 ......... 22

2.2.1.1. Khuếch đại đoạn gen mã hóa cho sIL-33R của chuột ............... 22

2.2.1.2. Phân tích DNA bằng điện di trên gel agarose ........................... 23

2.2.1.3. Tinh sạch DNA ........................................................................ 23

2.2.1.4. Cắt hạn chế DNA bằng NotI và HindIII ................................... 24

2.2.1.5. Phản ứng nối DNA bằng ligase ................................................ 25

2.2.1.6. Biến nạp plasmid vào E. coli DH5α khả nạp ............................ 25

2.2.1.7. Tách chiết plasmid từ E. coli .................................................... 26

2.2.2. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn ...................................................... 27

2.2.2.1. Nuôi cấy E. coli DH5α ............................................................. 27

2.2.2.2. Bảo quản E. coli DH5α mang plasmid ..................................... 27

2.2.2.3. Tạo tế bào khả nạp E. coli DH5α bằng phương pháp

hóa biến nạp ............................................................................. 27

2.2.3. Phương pháp nuôi cấy tế bào HEK293 ........................................... 28

2.2.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào EL-4 ................................................. 29

2.2.5. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào HEK293 ........................ 29

2.2.6. Phương pháp phân giải tế bào ......................................................... 30

2.2.7. Phương pháp Bradford định lượng protein ...................................... 30

iv

2.2.8. Phương pháp thu nhận msIL-33R:Fc hIgG1từ dịch nuôi cấy

tế bào HEK293............................................................................... 31

2.2.9. Phương pháp thủy phân nhóm đường trên glycoprotein

msIL-33R:Fc hIgG1 bằng PNGase F ............................................... 32

2.2.10. Phương pháp tạo IL-33 chuột đánh dấu biotin ............................... 32

2.2.11. Phương pháp SDS-PAGE, Western Blotting ................................. 33

2.2.11.1. Điện di SDS-PAGE ................................................................ 33

2.2.11.2. Western Blotting .................................................................... 35

2.2.12. Phương pháp đồng kết tủa miễn dịch (co-immunoprecipitation) .... 36

2.2.12.1. Đồng kết tủa miễn dịch bio-mIL33 và msIL-33R:Fc hIgG1 ... 36

2.2.12.2. Đồng kết tủa miễn dịch bio-mIL33 và FLAG-IL33R ............. 36

2.2.13. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế IL-33 của

msIL-33R:Fc hIgG1 trên mô hình tế bào nuôi cấy ......................... 37

2.2.14. Phương pháp ELISA định lượng mIL-2 ........................................ 38

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 39

3.1. Tạo dòng plasmid pmsIL33R-Fc mang gen mã hóa protein

msIL-33R:Fc hIgG1 ................................................................................ 39

3.1.1. Khuếch đại, thu nhận đoạn gen mã hóa thụ thể IL-33 dạng tự do

của chuột và chuẩn bị vector Signal pIgplus cho tạo dòng ................. 39

3.1.2. Tạo plasmid Signal pIgplus tái tổ hợp mang gen mã hóa protein

msIL-33R:Fc hIgG1 .......................................................................... 40

3.2. Biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 từ tế bào

người HEK293......................................................................................... 42

3.3. Phân tích một số đặc điểm của protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 ..... 44

3.3.1. Sự đường hóa của msIL-33R:Fc hIgG1 tái tổ hợp biểu hiện

từ HEK293 ........................................................................................ 44

3.3.2. Protein msIL-33R:Fc hIgG1 được biểu hiện và tiết ra môi trường

ngoại bào ở dạng dimer ..................................................................... 46

3.4. Biểu hiện IL-33 chuột có đánh dấu biotin từ vi khuẩn E.coli .................... 48

v

3.5. Sự tương tác của msIL-33R:Fc hIgG1 với bio-mIL33 trong điều kiện

in vitro .............................................................................................................. 50

3.6. Sự cạnh tranh của msIL-33R:Fc hIgG1 với IL-33R biểu hiện ở bề mặt

tế bào trong việc tương tác với bio-mIL33 ............................................... 52

3.7. Khả năng ức chế hoạt động IL-33 của msIL-33R:Fc hIgG1 trên mô hình

tế bào EL-4 nuôi cấy in vitro .................................................................... 55

CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................... 59

4.1. Kết luận .................................................................................................... 59

4.2. Đề nghị ..................................................................................................... 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 60

PHỤ LỤC .

LINK DOWNLOAD