GIÁO TRÌNH - Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản (Đặng Thị Hoàng Anh) Full



Quá trình xét nghiệm bệnh phẩm thủy sản thường có nhiều khảnăng ngườiphân tích thu được kết quảchẩn đoán là các tác nhân gây bệnh cơhội hơn là tácnhân gây bệnh chủyếu.Kết quảchẩn đoán bệnh phụthuộc rất lớn vào tính sẵn có của phương pháp chẩn đoán đang được áp dụng ởphòng thí nghiệm,lãnh vực nghiên cứu của người thực hiện việc chẩn đoán hoặc những phép chẩn đoán được phát triển trên cơsởcác loài địa phương. Nắm vững nguyên tắc của các kỹthuật đoán và cách đọc kết quảmột cách chuẩn xác có ý nghĩa rất quan trọng.

Môn học nguyên lý và kỹthuật chẩn đoán bệnh thủy sản là môn học kỹthuật chuyên ngành bệnh học thủy sản cung cấp cho sinh viên những hiểu biết vềnguyên lývàphương pháp thực hiện các kỹthuật chẩn đoán bệnh ởthủy sản. Đồng thời môn học cũng giới thiệucác lãnh vực ứng dụng của các phương pháp trong chẩn đoán bệnh thủy sản. Một phương pháp có thể được ứng dụng đểphát hiện/chẩn đoán nhiều mầm bệnh. 

Phần thực hành của môn học cung cấp những kiến thức và kỹnăng hỗtrợcho phần lý thuyết và cũng là cơsở đểsinh viên tiếp cận các phương pháp cơbản trong chẩn đoán bệnh thủy sản. 

Phần tài liệu thamkhảo được sửdụng đểxây dựng giáo trình được trình bày sau mỗi chương. Sinh viên có thểtìm thấy các tài liệu này từtrung tâm học liệu Đại học Cần thơ, thưviện Khoa Thủy sản hay tài liệu cá nhân của giảng viên. 



NỘI DUNG:


CHƯƠNG I: NHỮNG KIẾN THỨC TỔNG QUÁT...........................................................10

I.1. SỨC KHỎE VÀ ĐỘNG VẬT THỦY SẢN.............................................................10

I.2. NHỮNG VẤN ĐỀCHUNG TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỦY SẢN........10

I.2.1. Sự đồng nhất trong thao tác thu, xửlý và phân tích mẫu.....................................10

I.2.2. So sánh kết quảgiữa các phòng thí nghiệm..........................................................10

I.2.2.1. Các dạng kết quảvà ý nghĩa của chúng.........................................................10

I.2.2.2. Phương thức so sánh, ví dụ:...........................................................................11

I.2.3. Những vấn đềcần lưu ý........................................................................................11

I.2.3.1. Giá trịgiới hạn cho những phép phân tích....................................................11

I.2.3.2. Tính hiệu lực của phương pháp chẩn đoán....................................................11

I.2.3.3. Tính ổn định của phương pháp......................................................................11

I.2.3.4. Đối chứng.......................................................................................................11

I.2.4. Phát hiện và chẩn đoán bệnh.................................................................................12

I.2.4.1. Chẩn đoán lâmsàng.......................................................................................12

I.2.4.2. Những biện pháp sàng lọc (screening)..........................................................12

I.2.4.3. Phát hiện bệnh (detection).............................................................................12

I.2.4.4. Chẩn đoán bệnh (diagnostic).........................................................................12

I.2.4.5. Các con đường lây truyền bệnh (disease transmission).................................12

I.2.5. Vai trò của chẩn đoán trong quản lý dịch bệnh thủy sản......................................13

I.2.6. Các mức độtrong chẩn đoán bệnh thủy sản.........................................................13

I.2.6.1. Mức I:.............................................................................................................13

I.2.6.2. Mức 2:............................................................................................................14

I.2.6.3. Mức 3:............................................................................................................14

I.2.7. Phân nhóm kỹthuật phát hiện/chẩn đoán bệnh ởthủy sản...................................14

I.2.8. Các kỹthuật quan sát............................................................................................17

I.2.8.1. Những kỹthuật quan sát................................................................................17

I.2.8.2. Những kỹthuật mô học đặc biệt....................................................................17

I.2.8.3. Kỹthuật hiển vi điện tử.................................................................................17

I.2.8.4. Các kỹthuật nuôi vi sinh vật.........................................................................17

I.2.9. Các kỹthuật huyết thanh.......................................................................................17

I.2.10. Các kỹthuật phân tử...........................................................................................17

I.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG 1..................................................................18

CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁPQUAN SÁT.............................................................19

II.1. QUAN SÁT DẤU HIỆU BỆNH, MẪU GIẢI PHẪU TƯƠI VÀ MÔ BỆNH 

HỌC...................................................................................................................................19

II.1.1.Phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh...................................................................19

II.1.1.1.Những vấn đềcần lưu ý khi quan sát bệnh lý thủy sản.................................19

3

II.1.1.2. Quan sát bệnh lý ởtôm.................................................................................20

II.1.1.3.Phương pháp quan sát bệnh lý ởcá...............................................................22

II.1.2. Phương pháp quan sát mẫu giải phẫu tươi..........................................................25

II.1.3. Phương pháp mô học...........................................................................................26

II.1.3.1. Mục tiêu........................................................................................................27

II.1.3.2. Những điều cần lưu ý khi sửdụng phương pháp môbệnh học:...................27

II.1.3.3. Phương pháp môhọc bao gồm các bước:.....................................................27

II.2. KỸTHUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH.....................................................................28

II.2.1. Nguyên tắc...........................................................................................................28

II.2.2. Ứng dụng.............................................................................................................28

II.2.3. Mẫu phân tích......................................................................................................29

II.2.4. Thao tác...............................................................................................................29

II.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp...................................................................29

II.2.5.1. Ưu điểm:.......................................................................................................29

II.2.5.2. Nhược điểm:.................................................................................................30

II.3. KỸTHUẬT NUÔI VI SINH VẬT.........................................................................30

II.2.1. Nuôi vi khuẩn......................................................................................................30

II.2.1.1. Ứng dụng......................................................................................................30

II.2.1.2. Phương pháp.................................................................................................30

II.2.1.3. Mẫu phân tích...............................................................................................31

II.2.1.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp............................................................31

II.2.2. Nuôi nguyên sinh động vật..................................................................................31

II.2.2.1. Ứng dụng......................................................................................................31

II.2.2.2. Phương pháp.................................................................................................31

II.2.2.3. Mẫu phân tích...............................................................................................31

II.2.2.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp............................................................31

II.2.3. Nuôi vi-rút...........................................................................................................31

II.2.3.1. Ứng dụng......................................................................................................31

II.2.3.2. Phương pháp.................................................................................................32

II.2.3.3. Mẫu phân tích...............................................................................................32

II.2.3.4. Đọc kết quả...................................................................................................32

II.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG II................................................................33

CHƯƠNG III: CÁC KỸTHUẬT HUYẾT THANH............................................................34

III.1. PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA MIỄN DỊCH..........................................................34

III.1.1. Nguyên lý...........................................................................................................34

III.1.2. Ứng dụng............................................................................................................35

III.1.3. Mẫu phân tích.....................................................................................................35

III.1.4. Các dạng khuếch tán miễn dịch.........................................................................35

III.1.4.1. Kết tủa trong môi trường lỏng.....................................................................35

III.1.4.2. Tủa trong môi trường gel............................................................................37

III.1.4.3. Miễn dịch khuếch tán điện..........................................................................38

III.1.4.4. Miễn dịch khuếch tán: Điện di với miễn dịch khuếch tán in situ...............38

III.1.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp.................................................................39

III.1.5.1. Ưu đi ểm:....................................................................................................39

III.1.5.2. Nhược điểm:................................................................................................39

4

III.2. PHƯƠNG PHÁPNGƯNG KẾT MIỄN DỊCH...................................................39

III.2.1. Nguyên lý...........................................................................................................39

III.2.2. Xếp loại các phản ứng ngưng kết.......................................................................40

III.2.2.1. Ngưng kết trực tiếp:....................................................................................40

III.2.2.2. Ngưng kết gián tiếp:....................................................................................40

III.2.2.3. Ngưng kết nhân tạo:....................................................................................40

III.2.3. Ứng dụng............................................................................................................41

III.2.4. Mẫu phân tích.....................................................................................................41

III.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp.................................................................41

III.2.5.1. Ưu đi ểm:....................................................................................................41

III.2.5.2. Nhược điểm:................................................................................................41

III.3. KỸTHUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG......................................................41

III.3.1. Nguyên lý...........................................................................................................41

III.3.2. Phương pháp.......................................................................................................42

III.3.2.1. Kỹthuật miễn dịch huỳnhquangtrực tiếp..................................................42

III.3.2.2. Kỹthuật miễn dịch huỳngquang gián tiếp.................................................42

III.3.3. Ứng dụng............................................................................................................43

III.3.4. Mẫu phân tích.....................................................................................................43

III.3.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp.................................................................43

III.3.5.1. Ưu điểm:......................................................................................................43

III.3.5.2. Nhược điểm:................................................................................................43

III.4. KỸTHUẬT MIỄN DỊCH LIÊN KẾT ENZYM.................................................44

III.4.1. Nguyên lý...........................................................................................................44

III.4.2. Ứng dụng............................................................................................................45

III.4.3. Mẫu phân tích.....................................................................................................45

III.4.4. Phương pháp.......................................................................................................45

III.4.4.1. Kỹthuật ELISA gián tiếp............................................................................45

III.4.4.2. Kỹthuật ELISA trực tiếp............................................................................46

III.4.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp.................................................................47

III.4.5.1. Ưu điểm:......................................................................................................47

III.4.5.2. Nhược điểm:................................................................................................47

III.5. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG III.............................................................47

CHƯƠNG 4: CÁC KỸTHUẬT PHÂNTỬ..........................................................................48

IV.1. KỸTHUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP...............................................48

IV.1.1. Nguyên tắc.........................................................................................................48

IV.1.1.1. Giai đoạn biến tính (denaturation):.............................................................48

IV.1.1.2. Giai đoạn lai (hybridization):......................................................................48

IV.1.1.3. Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension):...........................................48

IV.1.2. Ứng dụng............................................................................................................49

IV.1.3. Phương pháp......................................................................................................50

IV.1.3.1. Ly trích DNA hay RNA từvật chủ đểsửdụng làm mạchkhuôn...............50

IV.1.3.2. Chuẩn bị......................................................................................................50

IV.1.3.3. Đối chứng....................................................................................................51

IV.1.4. Các hạn chếcủa phương pháp PCR...................................................................52

IV.1.5. Các dạng PCR....................................................................................................52

5

IV.1.5.1. PCR truyền thống........................................................................................52

IV.1.5.2. PCR phiên mã ngược..................................................................................53

IV.1.5.3. PCR thời gian thật.......................................................................................54

IV.2. KỸTHUẬT PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG VỀCHIỀU DÀI ĐOẠN GIỚI 

HẠN...................................................................................................................................54

IV.2.1. Nguyên lý...........................................................................................................54

IV.2.2. Phương pháp......................................................................................................54

IV.2.3. Hệthống phi phóng xạDIG...............................................................................55

IV.2.4. Ứng dụng của kỹthuật lai Southern..................................................................56

IV.2.5. Mẫu phân tích.....................................................................................................57

IV.2.6. Ưu và nhược điểm..............................................................................................57

IV.2.6.1. Ưu điểm:.....................................................................................................57

IV.2.6.2. Nhược điểm:................................................................................................57

IV.3. KỸTHUẬT LAI IN SITU....................................................................................57

IV.3.1. Nguyên lý...........................................................................................................57

IV.3.2. Ứng dụng............................................................................................................57

IV.3.3. Mẫu phân tích.....................................................................................................57

IV.3.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp.................................................................58

IV.3.4.1. Ưu điểm:.....................................................................................................58

IV.3.4.2. Nhược điểm:................................................................................................58

IV.4. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG IV.............................................................58

CHƯƠNG V: MỘT SỐQUI TRÌNH PHÁTHIỆN BỆNH ỞTHỦY SẢN.......................59

V.1. PHÁT HIỆN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG ỞTÔM BẰNG KỸTHUẬT PCR.........59

V.1.1. Ðối tượng và phạm viápdụng............................................................................59

V.1.2. Tài liệu thamkhảo xây dựng tiêu chuẩn ngành..................................................59

V.1.3. Giải thích thuật ngữ.............................................................................................59

V.1.4. Thiết bị, dụng cụ, mồi và hóa chất......................................................................60

V.1.4.1. Thiết bị, dụng cụ...........................................................................................60

V.1.4.2. Mồi, hóa chất................................................................................................61

V.1.5. Chuẩn bịmẫu.......................................................................................................62

V.1.5.1. Sốlượng mẫu...............................................................................................62

V.1.5.2. Yêu cầu đối với mẫu đểphân tích................................................................63

V.1.6. Phương pháp tiến hành........................................................................................63

V.1.6.1. Xửlý mẫu....................................................................................................63

V.1.6.2. Phản ứng khuếch đại PCR............................................................................63

V.1.6.3. Tiến hành điện di..........................................................................................64

V.1.7. Ðọc kết quả..........................................................................................................64

V.1.8. Quy định về đảm bảo an toàn..............................................................................65

V.2. PHÁT HIỆN YHV VÀ GAV BẰNG KIT IQ2000 YHV/GAV............................65

V.2.1. Giới thiệu.............................................................................................................65

V.2.2. Thành phần..........................................................................................................65

V.2.3. Thiết bịvà hóa chất.............................................................................................66

V.2.4. Giới hạn phát hiện và tính nhạy..........................................................................67

V.2.5. Chuẩn bịmẫu và ly trích RNA............................................................................67

6

V.2.5.1 Thao tác ly trích RNA...................................................................................67

V.2.5.2. Hoà tan RNA................................................................................................68

V.2.6. Qui trình khuếch đại............................................................................................68

V.2.6.1. Chuẩn bịhoá chất phản ứng.........................................................................68

V.2.6.2. Điều kiện phản ứng......................................................................................68

V.2.6.3. Phương thức chuẩn bịphản ứng...................................................................69

V.2.7. Điện di.................................................................................................................70

V.2.7.1. Chuẩn bịbản thạch (gel)..............................................................................70

V.2.7.2. Điện di..........................................................................................................70

V.2.7.3. Thuốc nhuộmgel và đọc kết quả.................................................................71

V.2.8. Đọc kết quả..........................................................................................................71

V.2.9. Khắc phục sựcốkỹthuật....................................................................................73

V.3. PHÁT HIỆN VI KHUẨN ỞCÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP......................74

V.3.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩmvà phân lập vi khuẩn......................................74

V.3.2 Phương pháp RFLP..............................................................................................74

V.3.2.1. Ly trích DNA................................................................................................74

V.3.2.2. Cắt DNA bằng enzym giới hạn....................................................................74

V.3.2.3. Quá trình khửpuria, biến tính và thấmchuyển............................................75

V.3.2.4. Quá trình tiền lai và lai DNA trên màng......................................................75

V.3.2.5. Phát hiện các vạch DNA..............................................................................75

V.3.3. Xửlýthống kê.....................................................................................................75

V.3.4. Đọc kết quả..........................................................................................................76

PHỤLỤC 1: CÁC BƯỚC THU MẪU CHẨN ĐOÁN BỆNH............................................77

1. Phụlục 1a. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ởcá................................................77

2. Phụlục 1b. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ởtôm.............................................79

3. Phụlục 1c. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ởnhuyễn thể.................................80

PHỤLỤC 2: CÁC DẤU HIỆU BỆNH THƯỜNG GẶP ỞTÔM.......................................83

PHỤLỤC 3: CÁC DẤU HIỆU BỆNH THƯỜNG GẶP ỞCÁ..........................................87

PHỤLỤC 4: PHƯƠNG PHÁPNHUỘM HEMATOXYLIN VÀ PHLOXINE/EOSIN....90

1. Công thức pha thuốc nhuộm Hematoxylin và Phloxine/Eosin (H&E)...................90

2. Qui trình nhuộm Mayer-Bennett Hematoxylinvà Phloxine/Eosin (H&E)............90

PHỤLỤC 5: CÔNG THỨC DUNG DỊCH DAVIDSON,S AFA CỦA HUMASON,1972)

................................................................................................................................................92

PHỤLỤC 6: PHƯƠNG PHÁPNHUỘM NHANH PHÁT HIỆN MBV, YHV VÀ WSSV

................................................................................................................................................93

A. Phát hiện MBV bằngphươngpháp nhuộm Malachite Green................................93

B. Phát hiện YHV bằng phương pháp nhuộm Wright - Giemsa.................................94

C. Phát hiện WSSV bằng phương pháp nhuộm Haematoxylinevà Eosin..










LINK DOWNLOAD (TÀI LIỆU VIP MEMBER)



Quá trình xét nghiệm bệnh phẩm thủy sản thường có nhiều khảnăng ngườiphân tích thu được kết quảchẩn đoán là các tác nhân gây bệnh cơhội hơn là tácnhân gây bệnh chủyếu.Kết quảchẩn đoán bệnh phụthuộc rất lớn vào tính sẵn có của phương pháp chẩn đoán đang được áp dụng ởphòng thí nghiệm,lãnh vực nghiên cứu của người thực hiện việc chẩn đoán hoặc những phép chẩn đoán được phát triển trên cơsởcác loài địa phương. Nắm vững nguyên tắc của các kỹthuật đoán và cách đọc kết quảmột cách chuẩn xác có ý nghĩa rất quan trọng.

Môn học nguyên lý và kỹthuật chẩn đoán bệnh thủy sản là môn học kỹthuật chuyên ngành bệnh học thủy sản cung cấp cho sinh viên những hiểu biết vềnguyên lývàphương pháp thực hiện các kỹthuật chẩn đoán bệnh ởthủy sản. Đồng thời môn học cũng giới thiệucác lãnh vực ứng dụng của các phương pháp trong chẩn đoán bệnh thủy sản. Một phương pháp có thể được ứng dụng đểphát hiện/chẩn đoán nhiều mầm bệnh. 

Phần thực hành của môn học cung cấp những kiến thức và kỹnăng hỗtrợcho phần lý thuyết và cũng là cơsở đểsinh viên tiếp cận các phương pháp cơbản trong chẩn đoán bệnh thủy sản. 

Phần tài liệu thamkhảo được sửdụng đểxây dựng giáo trình được trình bày sau mỗi chương. Sinh viên có thểtìm thấy các tài liệu này từtrung tâm học liệu Đại học Cần thơ, thưviện Khoa Thủy sản hay tài liệu cá nhân của giảng viên. 



NỘI DUNG:


CHƯƠNG I: NHỮNG KIẾN THỨC TỔNG QUÁT...........................................................10

I.1. SỨC KHỎE VÀ ĐỘNG VẬT THỦY SẢN.............................................................10

I.2. NHỮNG VẤN ĐỀCHUNG TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỦY SẢN........10

I.2.1. Sự đồng nhất trong thao tác thu, xửlý và phân tích mẫu.....................................10

I.2.2. So sánh kết quảgiữa các phòng thí nghiệm..........................................................10

I.2.2.1. Các dạng kết quảvà ý nghĩa của chúng.........................................................10

I.2.2.2. Phương thức so sánh, ví dụ:...........................................................................11

I.2.3. Những vấn đềcần lưu ý........................................................................................11

I.2.3.1. Giá trịgiới hạn cho những phép phân tích....................................................11

I.2.3.2. Tính hiệu lực của phương pháp chẩn đoán....................................................11

I.2.3.3. Tính ổn định của phương pháp......................................................................11

I.2.3.4. Đối chứng.......................................................................................................11

I.2.4. Phát hiện và chẩn đoán bệnh.................................................................................12

I.2.4.1. Chẩn đoán lâmsàng.......................................................................................12

I.2.4.2. Những biện pháp sàng lọc (screening)..........................................................12

I.2.4.3. Phát hiện bệnh (detection).............................................................................12

I.2.4.4. Chẩn đoán bệnh (diagnostic).........................................................................12

I.2.4.5. Các con đường lây truyền bệnh (disease transmission).................................12

I.2.5. Vai trò của chẩn đoán trong quản lý dịch bệnh thủy sản......................................13

I.2.6. Các mức độtrong chẩn đoán bệnh thủy sản.........................................................13

I.2.6.1. Mức I:.............................................................................................................13

I.2.6.2. Mức 2:............................................................................................................14

I.2.6.3. Mức 3:............................................................................................................14

I.2.7. Phân nhóm kỹthuật phát hiện/chẩn đoán bệnh ởthủy sản...................................14

I.2.8. Các kỹthuật quan sát............................................................................................17

I.2.8.1. Những kỹthuật quan sát................................................................................17

I.2.8.2. Những kỹthuật mô học đặc biệt....................................................................17

I.2.8.3. Kỹthuật hiển vi điện tử.................................................................................17

I.2.8.4. Các kỹthuật nuôi vi sinh vật.........................................................................17

I.2.9. Các kỹthuật huyết thanh.......................................................................................17

I.2.10. Các kỹthuật phân tử...........................................................................................17

I.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG 1..................................................................18

CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁPQUAN SÁT.............................................................19

II.1. QUAN SÁT DẤU HIỆU BỆNH, MẪU GIẢI PHẪU TƯƠI VÀ MÔ BỆNH 

HỌC...................................................................................................................................19

II.1.1.Phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh...................................................................19

II.1.1.1.Những vấn đềcần lưu ý khi quan sát bệnh lý thủy sản.................................19

3

II.1.1.2. Quan sát bệnh lý ởtôm.................................................................................20

II.1.1.3.Phương pháp quan sát bệnh lý ởcá...............................................................22

II.1.2. Phương pháp quan sát mẫu giải phẫu tươi..........................................................25

II.1.3. Phương pháp mô học...........................................................................................26

II.1.3.1. Mục tiêu........................................................................................................27

II.1.3.2. Những điều cần lưu ý khi sửdụng phương pháp môbệnh học:...................27

II.1.3.3. Phương pháp môhọc bao gồm các bước:.....................................................27

II.2. KỸTHUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH.....................................................................28

II.2.1. Nguyên tắc...........................................................................................................28

II.2.2. Ứng dụng.............................................................................................................28

II.2.3. Mẫu phân tích......................................................................................................29

II.2.4. Thao tác...............................................................................................................29

II.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp...................................................................29

II.2.5.1. Ưu điểm:.......................................................................................................29

II.2.5.2. Nhược điểm:.................................................................................................30

II.3. KỸTHUẬT NUÔI VI SINH VẬT.........................................................................30

II.2.1. Nuôi vi khuẩn......................................................................................................30

II.2.1.1. Ứng dụng......................................................................................................30

II.2.1.2. Phương pháp.................................................................................................30

II.2.1.3. Mẫu phân tích...............................................................................................31

II.2.1.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp............................................................31

II.2.2. Nuôi nguyên sinh động vật..................................................................................31

II.2.2.1. Ứng dụng......................................................................................................31

II.2.2.2. Phương pháp.................................................................................................31

II.2.2.3. Mẫu phân tích...............................................................................................31

II.2.2.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp............................................................31

II.2.3. Nuôi vi-rút...........................................................................................................31

II.2.3.1. Ứng dụng......................................................................................................31

II.2.3.2. Phương pháp.................................................................................................32

II.2.3.3. Mẫu phân tích...............................................................................................32

II.2.3.4. Đọc kết quả...................................................................................................32

II.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG II................................................................33

CHƯƠNG III: CÁC KỸTHUẬT HUYẾT THANH............................................................34

III.1. PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA MIỄN DỊCH..........................................................34

III.1.1. Nguyên lý...........................................................................................................34

III.1.2. Ứng dụng............................................................................................................35

III.1.3. Mẫu phân tích.....................................................................................................35

III.1.4. Các dạng khuếch tán miễn dịch.........................................................................35

III.1.4.1. Kết tủa trong môi trường lỏng.....................................................................35

III.1.4.2. Tủa trong môi trường gel............................................................................37

III.1.4.3. Miễn dịch khuếch tán điện..........................................................................38

III.1.4.4. Miễn dịch khuếch tán: Điện di với miễn dịch khuếch tán in situ...............38

III.1.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp.................................................................39

III.1.5.1. Ưu đi ểm:....................................................................................................39

III.1.5.2. Nhược điểm:................................................................................................39

4

III.2. PHƯƠNG PHÁPNGƯNG KẾT MIỄN DỊCH...................................................39

III.2.1. Nguyên lý...........................................................................................................39

III.2.2. Xếp loại các phản ứng ngưng kết.......................................................................40

III.2.2.1. Ngưng kết trực tiếp:....................................................................................40

III.2.2.2. Ngưng kết gián tiếp:....................................................................................40

III.2.2.3. Ngưng kết nhân tạo:....................................................................................40

III.2.3. Ứng dụng............................................................................................................41

III.2.4. Mẫu phân tích.....................................................................................................41

III.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp.................................................................41

III.2.5.1. Ưu đi ểm:....................................................................................................41

III.2.5.2. Nhược điểm:................................................................................................41

III.3. KỸTHUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG......................................................41

III.3.1. Nguyên lý...........................................................................................................41

III.3.2. Phương pháp.......................................................................................................42

III.3.2.1. Kỹthuật miễn dịch huỳnhquangtrực tiếp..................................................42

III.3.2.2. Kỹthuật miễn dịch huỳngquang gián tiếp.................................................42

III.3.3. Ứng dụng............................................................................................................43

III.3.4. Mẫu phân tích.....................................................................................................43

III.3.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp.................................................................43

III.3.5.1. Ưu điểm:......................................................................................................43

III.3.5.2. Nhược điểm:................................................................................................43

III.4. KỸTHUẬT MIỄN DỊCH LIÊN KẾT ENZYM.................................................44

III.4.1. Nguyên lý...........................................................................................................44

III.4.2. Ứng dụng............................................................................................................45

III.4.3. Mẫu phân tích.....................................................................................................45

III.4.4. Phương pháp.......................................................................................................45

III.4.4.1. Kỹthuật ELISA gián tiếp............................................................................45

III.4.4.2. Kỹthuật ELISA trực tiếp............................................................................46

III.4.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp.................................................................47

III.4.5.1. Ưu điểm:......................................................................................................47

III.4.5.2. Nhược điểm:................................................................................................47

III.5. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG III.............................................................47

CHƯƠNG 4: CÁC KỸTHUẬT PHÂNTỬ..........................................................................48

IV.1. KỸTHUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP...............................................48

IV.1.1. Nguyên tắc.........................................................................................................48

IV.1.1.1. Giai đoạn biến tính (denaturation):.............................................................48

IV.1.1.2. Giai đoạn lai (hybridization):......................................................................48

IV.1.1.3. Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension):...........................................48

IV.1.2. Ứng dụng............................................................................................................49

IV.1.3. Phương pháp......................................................................................................50

IV.1.3.1. Ly trích DNA hay RNA từvật chủ đểsửdụng làm mạchkhuôn...............50

IV.1.3.2. Chuẩn bị......................................................................................................50

IV.1.3.3. Đối chứng....................................................................................................51

IV.1.4. Các hạn chếcủa phương pháp PCR...................................................................52

IV.1.5. Các dạng PCR....................................................................................................52

5

IV.1.5.1. PCR truyền thống........................................................................................52

IV.1.5.2. PCR phiên mã ngược..................................................................................53

IV.1.5.3. PCR thời gian thật.......................................................................................54

IV.2. KỸTHUẬT PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG VỀCHIỀU DÀI ĐOẠN GIỚI 

HẠN...................................................................................................................................54

IV.2.1. Nguyên lý...........................................................................................................54

IV.2.2. Phương pháp......................................................................................................54

IV.2.3. Hệthống phi phóng xạDIG...............................................................................55

IV.2.4. Ứng dụng của kỹthuật lai Southern..................................................................56

IV.2.5. Mẫu phân tích.....................................................................................................57

IV.2.6. Ưu và nhược điểm..............................................................................................57

IV.2.6.1. Ưu điểm:.....................................................................................................57

IV.2.6.2. Nhược điểm:................................................................................................57

IV.3. KỸTHUẬT LAI IN SITU....................................................................................57

IV.3.1. Nguyên lý...........................................................................................................57

IV.3.2. Ứng dụng............................................................................................................57

IV.3.3. Mẫu phân tích.....................................................................................................57

IV.3.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp.................................................................58

IV.3.4.1. Ưu điểm:.....................................................................................................58

IV.3.4.2. Nhược điểm:................................................................................................58

IV.4. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG IV.............................................................58

CHƯƠNG V: MỘT SỐQUI TRÌNH PHÁTHIỆN BỆNH ỞTHỦY SẢN.......................59

V.1. PHÁT HIỆN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG ỞTÔM BẰNG KỸTHUẬT PCR.........59

V.1.1. Ðối tượng và phạm viápdụng............................................................................59

V.1.2. Tài liệu thamkhảo xây dựng tiêu chuẩn ngành..................................................59

V.1.3. Giải thích thuật ngữ.............................................................................................59

V.1.4. Thiết bị, dụng cụ, mồi và hóa chất......................................................................60

V.1.4.1. Thiết bị, dụng cụ...........................................................................................60

V.1.4.2. Mồi, hóa chất................................................................................................61

V.1.5. Chuẩn bịmẫu.......................................................................................................62

V.1.5.1. Sốlượng mẫu...............................................................................................62

V.1.5.2. Yêu cầu đối với mẫu đểphân tích................................................................63

V.1.6. Phương pháp tiến hành........................................................................................63

V.1.6.1. Xửlý mẫu....................................................................................................63

V.1.6.2. Phản ứng khuếch đại PCR............................................................................63

V.1.6.3. Tiến hành điện di..........................................................................................64

V.1.7. Ðọc kết quả..........................................................................................................64

V.1.8. Quy định về đảm bảo an toàn..............................................................................65

V.2. PHÁT HIỆN YHV VÀ GAV BẰNG KIT IQ2000 YHV/GAV............................65

V.2.1. Giới thiệu.............................................................................................................65

V.2.2. Thành phần..........................................................................................................65

V.2.3. Thiết bịvà hóa chất.............................................................................................66

V.2.4. Giới hạn phát hiện và tính nhạy..........................................................................67

V.2.5. Chuẩn bịmẫu và ly trích RNA............................................................................67

6

V.2.5.1 Thao tác ly trích RNA...................................................................................67

V.2.5.2. Hoà tan RNA................................................................................................68

V.2.6. Qui trình khuếch đại............................................................................................68

V.2.6.1. Chuẩn bịhoá chất phản ứng.........................................................................68

V.2.6.2. Điều kiện phản ứng......................................................................................68

V.2.6.3. Phương thức chuẩn bịphản ứng...................................................................69

V.2.7. Điện di.................................................................................................................70

V.2.7.1. Chuẩn bịbản thạch (gel)..............................................................................70

V.2.7.2. Điện di..........................................................................................................70

V.2.7.3. Thuốc nhuộmgel và đọc kết quả.................................................................71

V.2.8. Đọc kết quả..........................................................................................................71

V.2.9. Khắc phục sựcốkỹthuật....................................................................................73

V.3. PHÁT HIỆN VI KHUẨN ỞCÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP......................74

V.3.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩmvà phân lập vi khuẩn......................................74

V.3.2 Phương pháp RFLP..............................................................................................74

V.3.2.1. Ly trích DNA................................................................................................74

V.3.2.2. Cắt DNA bằng enzym giới hạn....................................................................74

V.3.2.3. Quá trình khửpuria, biến tính và thấmchuyển............................................75

V.3.2.4. Quá trình tiền lai và lai DNA trên màng......................................................75

V.3.2.5. Phát hiện các vạch DNA..............................................................................75

V.3.3. Xửlýthống kê.....................................................................................................75

V.3.4. Đọc kết quả..........................................................................................................76

PHỤLỤC 1: CÁC BƯỚC THU MẪU CHẨN ĐOÁN BỆNH............................................77

1. Phụlục 1a. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ởcá................................................77

2. Phụlục 1b. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ởtôm.............................................79

3. Phụlục 1c. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ởnhuyễn thể.................................80

PHỤLỤC 2: CÁC DẤU HIỆU BỆNH THƯỜNG GẶP ỞTÔM.......................................83

PHỤLỤC 3: CÁC DẤU HIỆU BỆNH THƯỜNG GẶP ỞCÁ..........................................87

PHỤLỤC 4: PHƯƠNG PHÁPNHUỘM HEMATOXYLIN VÀ PHLOXINE/EOSIN....90

1. Công thức pha thuốc nhuộm Hematoxylin và Phloxine/Eosin (H&E)...................90

2. Qui trình nhuộm Mayer-Bennett Hematoxylinvà Phloxine/Eosin (H&E)............90

PHỤLỤC 5: CÔNG THỨC DUNG DỊCH DAVIDSON,S AFA CỦA HUMASON,1972)

................................................................................................................................................92

PHỤLỤC 6: PHƯƠNG PHÁPNHUỘM NHANH PHÁT HIỆN MBV, YHV VÀ WSSV

................................................................................................................................................93

A. Phát hiện MBV bằngphươngpháp nhuộm Malachite Green................................93

B. Phát hiện YHV bằng phương pháp nhuộm Wright - Giemsa.................................94

C. Phát hiện WSSV bằng phương pháp nhuộm Haematoxylinevà Eosin..










LINK DOWNLOAD (TÀI LIỆU VIP MEMBER)

M_tả
M_tả

Không có nhận xét nào: