Nghiên cứu tạo dòng tế bào cho DG44 mang gen sản xuất kháng thể đơn dòng tái tổ hợp kháng thụ thể HER2 (Đinh Văn Long) Full

Ngay từnăm 1998, FDA đã cho phép sửdụng kháng thể đơn dòng kháng thụthểHER2 trong việc điều trịcho các bệnh nhân ung thưvú dương tính với HER2. Đây là một bước tiến dài trong công nghệsinh dược phẩm cũng là bước đầu để bệnh nhân tiếp cận với các thuốc điều trịcó nguồn gốc sinh học an toàn với sức khoẻ và ít xâm lấn. Đây chính là liệu pháp trúng đích, sửdụng kháng thể đểtấn công trực tiếp các tếbào ung thưvà tiêu diệt chúng dựa trên chính hệmiễn dịch của cơthểngười bệnh mà không gây ảnh hưởng lớn tới các tếbào khoẻmạnh. Tuy nhiên đến nay, việc điều trịung thưvú ởViệt Nam vẫn sửdụng các phương pháp nhưhoá trị, xạtrịliều cao, phẫu thuật cắt bỏkhối u. Đây là các phương pháp điều trịxâm lấn gây đau đớn

vềsức khoẻcũng nhưtổn hại đến tinh thần của người bệnh. Hơn nữa các biện pháp chữa trịhiện nay vẫn chưa loại bỏhoàn toàn khảnăng tái phát. Một tỉlệkhông nhỏcác bệnh nhân phải điều trịnhiều lần gây tốn kém. Mặc dù thuốc chứa kháng thể đơn dòng kháng thụ thể HER2 có nguồn gốc sinh học đã được bán ởthịtrường trong nước tuy nhiên giá thành rất cao, vượt xa khảnăng chi trảcủa bệnh nhân. Với mục tiêu tạo dòng thành công dòng tếbào CHO DG44 biểu hiện kháng thể đơn dòng tái tổhợp kháng lại thụthểHER2 sửdụng trong nghiên cứu, xa hơn là thuốc chữa bệnh có nguồn gốc kháng thểcho các bệnh nhân ung thưvú dương tính với thụthểHER2, chúng tôi tiến hành đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG TẾ BÀO CHO DG44 MANG GEN SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG TÁI TỔHỢP KHÁNG THỤTHỂHER2.

Đềtài thực hiện một sốnội dung sau:

1. Khảo sát đường cong tăng trưởng của tếbào CHO DG44 trước chuyển gen

2. Khảo sát đường cong giết tếbào Cho DG44 bằng kháng sinh Zeocin

3. Tối ưu hoá quy trình chuyển gen kháng thể đơn dòng tái tổhợp kháng thụthểHER2 vào tếbào nhận CHO DG44

4. Khảo sát các đặc tính của tếbào chuyển gen

5. Khuếch đại gen mục tiêu trong tếbào chuyển gen sửdụng MTX

6. Khảo sát các đặc tính của tếbào chuyển gen ổn định

NỘI DUNG:

Danh mục ký hiệu, các chữviết tắt .................................................................................v

Danh mục các hình ........................................................................................................vii

Danh mục các bảng ........................................................................................................ix

LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................x

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. ThụthểHER2 và ung thưvú ...................................................................................1

1.1.1. Thụthểcủa nhân tốtăng trưởng biểu mô 2 (Human epidermal

receptor 2) ................................................................................................................ .1

1.1.2. Con đường truyền tín hiệu của HER2 và quá trình điều hoà biểu hiện ......... .2

1.1.3. ThụthểHER2 và ung thưvú ......................................................................... .4

1.2. Liệu pháp kháng thểtrong điều trịtrúng đích tếbào ung thưvú ............................ .5

1.2.1. Lịch sửnghiên cứu kháng thể........................................................................ .5

1.2.2. Cấu trúc của kháng thể.................................................................................. .7

1.2.2.1. Đặc điểm chung của cấu trúc kháng thể............................................... .7

1.2.2.2. Đặc điểm cấu trúc của vùng biến đổi và mối liên quan với sựliên kết

kháng nguyên...................................................................................................... .9

1.2.2.3. Đặc điểm cấu trúc của Fc và mối liên quan với chức năng hoạt hoá. 10

1.2.3. Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng và các phương pháp sản

xuất kháng thể....................................................................................................... 12

1.2.3.1. Kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng ......................................... 12

1.2.3.2. Các phương pháp sản xuất kháng thể................................................. 12

1.2.4. Kháng thể đơn dòng và quá trình nhân hoá kháng thể................................ 14

1.2.1.1. Kháng thể đơn dòng .......................................................................... 14

1.2.1.2. Quá trình nhân hoá kháng thể.......................................................... 15

1.2.5. Điều trịung thưvú trúng đích sửdụng kháng thể đơn dòng tái tổ

hợp kháng thụthểHER2 ....................................................................................... 21

1.2.6. Các dạng kháng thể đơn dòng tái tổhợp kháng HER2 ứng dụng trong

điều trịung thưvú ..................................................................................................26

1.3. Giới thiệu vềquá trình chuyển gen và biểu hiện protein tái tổhợp trong tếbào

động vật hữu nhũ.......................................................................................................... 30

1.3.1. Hệthống biểu hiện ....................................................................................... 30

1.3.1.1. Vector biểu hiện ................................................................................... 30

1.3.1.2. Promoter và Enhancer ......................................................................... 31

1.3.1.3. Monocistronic và Dicistronic .............................................................. 34

1.3.1.4. Hệthống DHFR và quá trình khuếch đại gen bằng Methotrexate

(MTX) ................................................................................................................ 36

1.3.2. Quá trình chuyển gen và biểu hiện protein tái tổhợp ởtếbào động vật 41

1.3.2.1. Các phương pháp chuyển gen ............................................................. 41

1.3.2.2. Chuyển gen tạm thời và chuyển gen cố định ....................................... 43

1.3.2.3. Tạo dòng ............................................................................................. 45

1.3.2.4. Nuôi cấy lớn và sản xuất ởquy mô công nghiệp ................................. 47

1.3.2.5. Tinh chếkháng thểbằng phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch sửdụng

gel Protein A ..................................................................................................... 49

Chương 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu ................................................................................................................... 52

2.1.1. Tếbào DG44 (Invitrogen) ............................................................................ 52

2.1.2. Môi trường PowerCHO2 (Lonza) ................................................................ 52

2.1.3. Plasmid chuyển gen ...................................................................................... 52

2.1.4. Lipofectamine LTX (Invitrogen) ................................................................. 54

2.1.5. Herceptin (Roche) ........................................................................................ 55

2.2. Hoá chất dụng cụ.................................................................................................... 55

iii

2.2.1. Các hoá chất cơbản ..................................................................................... 55

2.2.2. Dụng cụ- Thiết bị........................................................................................ 56

2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 57

2.3.1. Sơ đồnghiên cứu .......................................................................................... 57

2.3.2. Các phương pháp nuôi cấy, chuyển gen và chọn lọc tếbào58

2.3.2.1. Xây dựng đường cong tăng trưởng của tếbào .................................... 58

2.3.2.2. Phương pháp cấy chuyền tếbào .......................................................... 58

2.3.2.3 Phương pháp bảo quản lạnh tếbào sửdụng DMSO ........................... 59

2.3.2.4. Phương pháp giải đông tếbào ............................................................ 59

2.3.2.5. Phương pháp xác định đường cong giết tếbào bằng Zeocine ............ 59

2.3.2.6. Phương pháp chuyển gen vào tếbào ................................................... 60

2.3.2.7. Phương pháp chọn lọc tếbào chuyển gen ........................................... 60

2.3.2.8. Phương pháp khuếch đại gen trong tếbào chuyển gen ...................... 61

2.3.2.9. Phương pháp xác định đường cong tăng trưởng của tếbào ............... 61

2.3.3. Các phương pháp kiểm tra sựbiểu hiện gen ................................................ 62

2.3.3.1. SDS PAGE ........................................................................................... 62

2.3.3.2. Dot blot ................................................................................................ 63

2.3.3.3. ELISA trực tiếp .................................................................................... 65

2.3.3.4. Reverse Transciption – PCR................................................................ 66

2.3.3.5. Kiểm tra nhiễm Mycoplasma ............................................................... 68

Chương 3. KẾT QUẢ- BIỆN LUẬN

3.1. Kết quảnuôi cấy và khảo sát tếbào CHO DG44................................................... 69

3.1.1. Nuôi cấy tếbào CHO DG44 ........................................................................ 69

3.1.2. Đường cong tăng trưởng tếbào CHO DG44 trước chuyển gen .................. 69

3.1.3. Đường cong giết tếbào CHO DG44 bằng kháng sinh Zeocin .................... 71

3.2. Tối ưu hoá quy trình chuyển gen Anti-HER2 rmAb vào tếbào CHO DG44 ........ 74

3.2.1. Các nghiệm thức chuyển gen ....................................................................... 74

3.2.2. Đánh giá biểu hiện gen tạm thời .................................................................. 76

3.2.2.1. Dot blot ................................................................................................ 76

3.2.2.2. ELISA trực tiếp .................................................................................... 77

3.3. Kết quảchọn lọc tếbào sau chuyển gen với quy trình đã tối ưu ........................... 80

3.3.1. Dot blot ......................................................................................................... 80

3.3.2. ELISA trực tiếp ............................................................................................ 80

3.3.3. Sựchèn gen Anti-HER2 rmAb vào bộgen tếbào CHO DG44 ................... 82

3.3.4. Sựbiểu hiện gen Anti-HER2 rmAb ởmức độphiên mã trong tế

bào CHO DG44 ...................................................................................................... 83

3.3.5. SDS PAGE85

3.4. Khuếch đại gen biểu hiện kháng thể đơn dòng tái tổhợp kháng thụthểHER2

trong dòng tếbào CHO DG44 HER01 bằng MTX ....................................................... 86

3.5. Kết quảkhảo sát các đặc tính của dòng tếbào CHO DG44 HER02 ..................... 88

3.5.1. Đường cong tăng trưởng của dòng tếbào CHO DG44 HER02 ................... 88

3.5.2. Sản xuất kháng thể....................................................................................... 89

3.5.3. Kiểm tra nhiễm mycoplasma ....................................................................... 91

3.5.4. Kết quảbiểu hiện Anti-HER2 rmAb của tếbào CHO DG44 HER02 sau

bảo quản lạnh 2, 4 tháng ........................................................................................92

Chương 4. KẾT LUẬN-ĐỀNGHỊ

4.1. Kết luận .................................................................................................................. 94

4.2. Đềnghị................................................................................................................... 95

Tài liệu tham khảo ......................................................................................................... 96

Phụlục ...

LINK 1 - TÌM KIẾM SÁCH/TÀI LIỆU ONLINE (GIÁ ƯU ĐÃI NHẤT)

LINK 2 - TÌM KIẾM SÁCH/TÀI LIỆU ONLINE (GIÁ ƯU ĐÃI NHẤT)

LINK 3 - TÌM KIẾM SÁCH/TÀI LIỆU ONLINE (GIÁ ƯU ĐÃI NHẤT)

LINK 4 - TÌM KIẾM SÁCH/TÀI LIỆU ONLINE (GIÁ ƯU ĐÃI NHẤT)

LINK DOWNLOAD (TÀI LIỆU PRO)