Nghiên cứu sự methyl hóa và mức độ biểu hiện của gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn ở cây lúa (oryza sativa)

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẤT NHIỄM MẶN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NÓ ĐỐI VỚI CÂY LÚA 1.1.1 Khái quát đất nhiễm mặn 1.1.2 Tình hình đất nhiễm mặn Việt Nam 1.1.3 Ảnh hưởng đất nhiễm mặn đến sinh trưởng phát triển lúa .6 1.2 GIỚI THIỆU VỀ HỌ GEN SALT OVERLY SENSITIVE (SOS) Ở THỰC VẬT 10 1.2.1 Giới thiệu chung họ gen SOS .10 1.2.2 Vai trò SOS khả chống chịu mặn trồng 12 1.2.3 Giới thiệu gen SOS1 lúa 14 1.3 HIỆN TƯỢNG METHYL HĨA ADN VÀ VAI TRỊ CỦA METHYL HĨA ADN TRONG CHỐNG CHỊU STRESS Ở CÂY TRỒNG 15 1.3.1 Khái quát tượng methyl hóa ADN .15 1.3.2 Mối liên quan methyl hóa ADN khả chống chịu điều kiện bất lợi thực vật 16 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HÓA, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN SOS1 Ở THỰC VẬT TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM 18

1.4.1 Tình hình nghiên cứu Methyl hóa gen SOS1 18 1.4.2 Tình hình nghiên cứu biểu gen SOS1 điều kiện mặn 18 1.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU METHYL HÓA 19 1.5.1 MSP (Methyl Specific PCR) 19 1.5.2 Giải trình tự bisulfite .21 1.6 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN Ở MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ 22 1.6.1 Real Time RT-PCR (reverse transcription PCR) 22 1.6.2 RT – PCR sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang 23 1.6.3 RT – PCR sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang (RT – PCR TaqMan) .23 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 25 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 25 v 2.1.2 Mồi phản ứng PCR 25 2.1.3 Hóa chất 26 2.1.4 Thiết bị dùng nghiên cứu .27 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.2.1 Trồng cây, xử lý mặn, thu mẫu phương pháp đánh giá kiểu hình .27 2.2.2.1 Thiết kế mồi cho phản ứng MSP 28 2.2.3 Nhóm phương pháp sử dụng nghiên cứu methyl hóa gen SOS1 .29 2.2.4 Nhóm phương pháp sử dụng nghiên cứu mức độ biểu gen SOS1 32 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM KIỂU HÌNH 35 3.1.1 Đánh giá đặc điểm hình thái 35 3.1.2 Đánh giá đặc điểm sinh lý, sinh hóa giống lúa 36 3.2 ĐÁNH GIÁ SỰ METHYL HÓA CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN 38 3.2.1 Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng MSP 38 3.2.2 Đánh giá methyl hóa gen SOS1 40 3.2.3 Phân tích vị trí cytosine bị methyl hóa gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn 41 3.3 ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN 44 3.3.1 Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng Real time PCR .44 3.3.2 Đánh giá ảnh hưởng điều kiện mặn đến mức độ biểu gen SOS1 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 vi BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribo Nucleic Cs Cộng DEGs Differentially expressed genes IRRI International Rice Research Institute NCBI National Center for Biotechnology Information MSP Methyl specific polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp đặc hiệu methyl) PCR Polymerase Chain Reaction RT-qPCR real-time reverse transcription polymerase chain reaction SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình nucleotide đơn) TBE Tris borate EDTA TE Tris – EDTA ScaBP8 Calcium Binding Protein SOS Salt Overly Sensitive vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tình trạng xâm nhập mặn đồng sơng Cửu Long Hình 1.2 Ảnh hưởng mặn đến hình thái lúa Hình 1.3 Các nhóm gen liên quan đến khả chịu mặn mức độ rễ, thân Hình 1.4 Con đường SOS tham gia trì cân ion rễ 11 Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc gen SOS1 lúa 14 Hình 1.6 Sơ đồ đại diện đường methyl hóa cytosine, demethylation, mutagenesis cytosine 5-mC 16 Hình 1.7 Methylate-specific PCR 20 Hình 1.8 Xác định methyl hóa cách sử dụng methylSEQr™ AB Bisulfite Conversion Kit thiết bị CE để phân tích DNA 22 Hình 1.9 Sơ đồ real-time PCR TaqMan 24 Hình 2.1 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 31 Hình 3.1 Biểu đồ điểm xếp hạng trung bình giống lúa sau 14 ngày xử lý mặn.35 Hình 3.2 Biểu đồ đặc điểm sinh lý, sinh hóa giống lúa điều kiện thường sau 14 ngày xử lý mặn 100 mM NaCl 37 Hình 3.3 Cấu trúc gen SOS1 với vùng methyl hóa cao b c 38 Hình 3.4 Kết khảo sát methyl hóa vùng promoter gen SOS1 39 Hình 3.5 Sơ đồ vị trí bắt cặp mồi methyl gen SOS1 40 Hình 3.6 Đánh giá methyl hóa gen SOS1 PCR (MSP) giống lúa tương ứng xử lý mặn (100 mM NaCl) giống đối chứng thời điểm 1, 3, 24 sau xử lý mặn 41 Hình 3.7 Kết giải trình tự gen SOS1 giống Nipponbare 43 Hình 3.8 Kết đo đường cong nóng chảy 45 Hình 3.9 Biểu gen SOS1 giống lúa phân tích phương pháp realtime PCR định lượng 46 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các loại đất mặn (phân theo nồng độ) ảnh hưởng trồng Bảng 1.2 Khả chịu mặn số loại trồng Bảng 1.3 Quan hệ EC suất lúa Bảng 2.1 Danh sách mồi sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 2.2 Chỉ số scoring để đánh giá đặc điểm hình thái IRRI 28 Bảng 2.3 Các thành phần phản ứng PCR 30 Bảng 3.1 Các vị trí nucleotit bị methyl hóa 43 ix MỞ ĐẦU Biến đổi khí hậu làm gia tăng tần suất lũ lụt, hạn hán, nước biển dâng thay đổi quy luật mùa vụ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống nhân sinh tác động trực tiếp đến sản xuất nông nghiệp, đặc biệt sản xuất lúa nước Đất nhiễm mặn gây ảnh hưởng đến suất, chất lượng trồng vấn đề đất nhiễm mặn ngày thách thức lớn sản xuất lúa [26] Lúa lương thực quan trọng giới, nguồn lương thực ni sống 1/3 dân số giới Việt Nam với 75% dân số phụ thuộc chủ yếu vào sản xuất nông nghiệp 100% người Việt Nam sử dụng lúa gạo làm lương thực Tuy nhiên, tình trạng đất nhiễm mặn ngày gia tăng, suất lúa trồng vùng đất nhiễm mặn bị giảm, chí nhiều nơi bị trắng Do đó, đất trồng lúa bị xâm nhiễm mặn trở ngại khó khăn lớn nơng dân vấn đề gây tác động đến an ninh lương thực Quốc gia Như vậy, giải pháp chiến lược có tính bền vững để hạn chế ảnh hưởng nhiễm mặn đến sản xuất lúa gieo cấy giống lúa có khả chịu mặn [26] Methyl hóa ADN có vai trò quan trọng việc điều hòa biểu gen, làm tắt hoạt động transposon đáp ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường Sự hiểu biết methyl hóa ADN gen giúp hiểu rõ vai trò gen khả chống chịu trồng Gen Salt Overly Sensitive (SOS1) chứng minh có vai trò quan trọng việc đào thải Na+ khỏi tế bào, góp phần vào khả chống chịu mặn trồng Tuy nhiên, điều hòa biểu gen SOS1 thơng qua chế methyl hóa ADN điều kiện mặn chưa nghiên cứu lúa Chính vậy, chúng tơi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu methyl hóa mức độ biểu gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn lúa (Oryza sativa)” nhằm đánh giá methyl hóa ADN mức độ biểu gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn lúa, đồng thời đặt sở khoa học bước đầu nghiên cứu chế điều hòa biểu gen SOS1 thơng qua chế methyl hóa ADN điều kiện mặn Hình 3.6 Đánh giá methyl hóa gen SOS1 PCR (MSP) giống lúa tương ứng xử lý mặn (100 mM NaCl) giống đối chứng thời điểm 1, 3, 24 sau xử lý mặn Chú thích: Giếng M: Sản phẩm phản ứng MSP sử dụng cặp mồi methyl hóa cytosine; Giếng U: Sản phẩm phản ứng MSP sử dụng cặp mồi khơng methyl hóa cytosine Kết điện di cho thấy khơng có khác biệt đáng kể tình trạng methyl hóa vùng mã gen SOS1 tất giống lúa nghiên cứu Dưới điều kiện thường điều kiện mặn thời điểm khác nhau, khuếch đại quan sát cặp mồi thiết kế cho methyl cytosine vùng mã hóa, cho thấy gen SOS1 bị methyl hóa cao đảo CpG 3.2.3 Phân tích vị trí cytosine bị methyl hóa gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn Để kiểm tra vị trí xác Cytosine bị methyl hóa (đảo CpG, CHG hay CHH) chúng tơi tiến hành giải trình tự bisulfite (sử dụng sản phẩm MSP khuếch đại từ Nipponbare thu sau xử lý mặn) Sản phẩm MSP (25μl) tinh cách sử dụng Gel Purification Kit (ThermoScientific) gửi giải trình tự 1st Base Company (Singapore) Trạng thái methyl hóa ADN thu cách so sánh trình tự ADN xử lý với bisulfit với ADN chưa xử lý, chuyển đổi từ C sang T cho thấy C khơng bị methyl hóa, không chuyển đổi từ C sang T cho thấy C bị methyl hóa Kết giải trình tự bisulfite tồn đoạn trình tự methyl hóa cao (đoạn b) giống Nipponbare đoạn trình tự tương ứng mẫu đối chứng trình bày hình 3.7: 41 A f B A B A B 42 A B Hình 3.7 Kết giải trình tự gen SOS1 giống Nipponbare Chú thích: Hình 3.7A : Kết giải trình tự bisulfite sử dụng cặp mồi Methyl Hình 3.7B: Kết giải trình tự mẫu đối xứng khơng xử lý bisulfite Các vị trí khoanh vùng hình 3.7A thể vị trí Cytosine bị methyl hóa xử lý bisulfite Sau so sánh đoạn trình tự nucleotit để tìm vị trí Cytosine bị methyl hóa chúng tơi thu bảng sau: Bảng 3.1 Các vị trí nucleotit bị methyl hóa Vị trí nu 59 128 142 149 Vùng trình tự có C bị methyl hóa Đảo CpG Đảo CpG Đảo CpG Đảo CpG Kết cho thấy hai cặp mồi MSP methyl cytosines đặc hiệu quan sát đảo CpG, không xảy vùng CHG CHH Như mô tả trước đây, mức độ methyl hóa sử dụng để phân biệt giống chịu mặn Ví dụ, 10 ngày sau xử lý mặn, giống lúa mỳ có khả chịu mặn có mức độ methyl hóa cao giống lúa mỳ nhạy cảm với mặn [56] Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng giống lúa có mức độ chịu mặn khác nhau, 43 bao gồm giống chịu mặn (Pokkali, Nếp Nõn Tre) giống nhạy cảm muối (Nipponbare, Dâu Ấn Độ), kết cho thấy khơng có khác biệt tình trạng methyl hóa giống lúa chịu mặn giống mẫn cảm sau xử lý mặn (1, 24 sau nhiễm mặn) 3.3 ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN 3.3.1 Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng Real time PCR Để đánh giá mức độ biểu gen sau tách chiết ARN tổng số, tổng hợp cADN sử dụng phản ứng Real time RT-PCR dùng dye SYBR-Green, trước hết cần phải thiết kế mồi 3.3.1.1.Thiết kế mồi Trình tự gen SOS1 (LOC_Os12g44360) Actin lấy từ sở liệu ngân hàng gen lúa Rice Genome Annotation project Sau Cặp mồi SOS1-Forward/ SOS1Reverse thiết kế phần mềm Primer Blast để sử dụng cho phản ứng PCR nhân đoạn trình tự gen SOS1 từ cDNA giống lúa Nipponbare, Pokkali, Nếp Nõn Tre Dâu Ấn Độ xử lý mặn Trình tự mồi cần đảm bảo khơng chứa cấu trúc bậc hai, khu vực giàu G/C A/T phân bố đồng khơng có trình tự bổ trợ hai đầu 3’ để tránh tượng tự mồi Sử dụng phần mềm Primer-Blast thiết kế mồi bảng 2.1 3.3.1.2 Đánh giá độ đặc hiệu mồi Sau thiết kế mồi cho phản ứng RT-qPCR tiến hành blast trình tự mồi gen SOS1 gen Actin sở liệu NCBI để xác định vị trí bắt cặp mồi gen Kết cho cặp mồi nhân đoạn trình tự mong muốn chứng tỏ rằng, mồi thiết kế mồi đặc hiệu Để kiểm tra độ đặc hiệu mồi phản ứng, chúng tơi tiến hành phân tích đường cong nóng chảy DNA (dissociation melting curves) thực cách giữ nhiệt độ 95°C 15 giây trước gia tăng nhiệt từ 60°C lên 95°C, kết thu hình 3.8 44 Hình 3.8 Kết đo đường cong nóng chảy Các nhóm đường cong hiển thị biểu đồ bên trái kết phân tích đường cong nóng chảy gen Actin 1, nhóm đường cong bên phải kết phân tích đường cong nóng chảy gen SOS1 Trục nằm ngang giá trị nhiệt độ, trục thẳng đứng giá trị cường độ huỳnh quang ( -dRn/dT) Đỉnh đường cong hiển thị nhiệt độ nóng chảy ADN Quan sát giá trị thu biểu đồ cho thấy, nhiệt độ nóng chảy gen Actin gen SOS1 tương tự 770C, đường cong nóng chảy tạo thành đỉnh Điều chứng minh mồi thiết kế đặc hiệu cho gen SOS1, Actin tiến hành phân tích kết thí nghiệm sau 3.3.2 Đánh giá ảnh hưởng điều kiện mặn đến mức độ biểu gen SOS1 Mức độ biểu gen SOS1 khảo sát mức độ phiên mã sử dụng phương pháp realtime PCR Các giống lúa trồng sử dụng phương pháp thủy canh Sau 14 ngày trồng điều kiện bình thường, giống lúa xử lý mặn nồng độ 100 mM NaCl tiến hành thu mẫu thời điểm sau xử lý mặn giờ, 24 Kết mức độ biểu gen so sánh giống xử lý mặn giống đối chứng thể theo giá trị fold change Phân tích biểu gen SOS1 thực cách sử dụng Realtime RTPCR với giống lúa tương ứng điều kiện thường độ mặn thời điểm khác (1, 24 sau xử lý mặn) để xác định ảnh hưởng stress mặn ngắn hạn biểu gen Như thể hình 3.9, biểu gen SOS1 khơng thay đổi sau giảm theo thời gian Pokkali đồng thời tăng lên sau xử lý mặn trước 45 giảm sau 24 xử lý mặn Nếp Nõn Tre Đặc biệt, sau 24 xử lý mặn, hai giống chịu mặn cho thấy giảm biểu gen SOS1, trái ngược với giống mẫn cảm, Nipponbare Dâu Ấn Độ, có gia tăng biểu gen SOS1 sau 24 Hình 3.9 Biểu gen SOS1 giống lúa phân tích phương pháp realtime PCR định lượng Quan sát giá trị Fold change thu mẫu lúa thời điểm ta thấy: Tại thời điểm thu mẫu sau xử lý mặn: Biểu gen SOS1 giống lúa Pokkali không đổi, Nếp Nõn Tre Dâu Ấn Độ tăng dần giống Nipponbare lại biểu giảm Tại thời điểm thu mẫu sau xử lý mặn: Biểu gen SOS1 giống Pokkali Dâu Ấn Độ giảm hai giống lại Nếp Nõn Tre Nipponbare tăng lên, đặc biệt tăng mạnh giống Nipponbare Tại thời điểm thu mẫu 24 sau xử lý mặn: Biểu gen SOS1 giống Pokkali Nếp Nõn Tre giảm hai giống Nipponbare Dâu Ấn Độ lại tăng lên (tăng mạnh giống Dâu Ấn Độ) 46 Khi so sánh giống thời điểm cho thấy: Ở Giống Pokkali: Biểu gen SOS1 Pokkali giảm dần sau thời điểm thu mẫu giờ, 24 Giống Nếp Nõn Tre: Biểu gen SOS1 tăng dần thời điểm giờ, sau giảm thời điểm 24 Giống Nipponbare: Biểu gen SOS1 Nipponbare giảm sau tăng thời điểm giờ, 24 cao Giống Dâu Ấn Độ: Biểu gen SOS1 tăng sau giảm sau giờ, tiếp tục tăng thời điểm 24 Chúng quan sát thấy, nhóm lúa chịu mặn, sau 24 biểu gen SOS1 có xu hướng giảm biểu gen SOS1 nhóm lúa mẫn cảm có xu hướng tăng lên • Thảo luận : Stress mặn làm thay đổi biểu gen thơng qua q trình methyl hóa ADN [17] Điều chứng minh methyl hóa ADN promoter liên quan đến mức độ biểu gen [61] Methyl hoá promoter liên quan đến ức chế hoạt động promoter cách can thiệp vào việc gắn thêm yếu tố phiên mã [47] ảnh hưởng đến khởi đầu phiên mã Mặc dù, có vài nghiên cứu liên quan đến ảnh hưởng methyl hóa ADN vùng mã hóa biểu gen, cho biết methyl hóa ADN vùng mã gen có ảnh hưởng tiêu cực đến biểu gen thực vật [24, 59] Methyl hóa ADN vùng mã hóa gen ảnh hưởng đến mức độ biểu gen cách kiểm soát kéo dài phiên mã [19] Trong nghiên cứu này, đánh giá methyl hóa vùng trình tự mã hóa gen SOS1 kết hợp với đánh giá mức biểu gen Tuy nhiên, kết cho cho thấy khơng có mối liên hệ tình trạng methyl hóa trình tự mã hóa gen SOS1 với mức biểu gen SOS1 (salt overly sensitive) chứng minh có liên quan đến khả chịu mặn thực vật cách thải loại ion Na+ khỏi tế bào Trong nghiên cứu này, sau 24 xử lý mặn, hai giống lúa chịu mặn (Pokkali, Nếp Nõn Tre) cho thấy mức biểu gen SOS1 giảm, hai giống mẫn cảm mặn (Nipponbare, Dâu Ấn Độ) đáp ứng với điều kiện mặn cách tăng mức độ biểu gen Lý để giải thích cho 47 kết mâu thuẫn thí nghiệm biểu tiến hành với mẫu Với nhóm mẫn cảm, mức biểu gen SOS1 tăng lên giúp thải loại ion Na+ qua tế bào mô nhiều, với nhóm chịu mặn biểu SOS1 giảm gen SOS1 hoạt động thải loại Na+ từ phần rễ 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Đã đánh giá đặc điểm kiểu hình giống lúa sử dụng phương pháp đo điểm kiểu hình lá, kết xác định giống lúa Nếp Nõn Tre Dâu Ấn Độ tương ứng thuộc nhóm kháng mặn giống mẫn cảm mặn Đối với giống Pokkali Nếp Nõn Tre, cho thấy khơng có ảnh hưởng đáng kể điều kiện mặn đến chiều cao cây, số nhánh, hàm lượng chlorophyll diện tích đặc điểm lại bị giảm đáng kể quan sát giống mẫn cảm, Nipponbare Dâu Ấn Độ Đã đánh giá mức độ methyl hóa hai vùng chứa exon thuộc gen SOS1 bốn giống lúa điều kiện bình thường mặn nhân tạo MSP-PCR giải trình tự bisulfite cho thấy đảo CG bị methyl hóa giống bốn giống lúa hai điều kiện Phân tích mức độ biểu gen SOS1 realtime RT-PCR cho thấy có thay đổi mức độ biểu gen SOS1 bốn giống lúa theo thời gian điều kiện mặn nhân tạo Kiến nghị Từ kết thu nghiên cứu, chúng tơi có kiến nghị sau: Giải trình tự bisulfite tồn vùng mã hóa promoter gen SOS1 để khảo sát methyl hóa toàn diện Đánh giá mức độ biểu gen SOS1 mẫu rễ 49

Tài liệu này do thành viên có TK Facebook (Cần Tây) sưu tầm và đóng góp cho thư viện. Thay mặt BQT EBOOKBKMT mình xin chân thành cảm ơn bạn rất nhiều :)

Mọi đóng góp cho thư viện, các bạn hoàn toàn có thể gửi trực tiếp về email của Admin nguyenphihung1009@gmail.com hoặc inbox qua Facebook https://www.facebook.com/Congdongkythuatcodienvietnam.VMTC/.

Thân!

LINK DOWNLOAD