NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA CHUYỂN GEN

1. Đã thay đổi mã di truyền của gen miraculin từ cây thần kỳ phù hợp với hệ biểu hiện ở cây họ cà. Đã phân lập, tách dòng thành công 3 trình tự: promoter E8 từ cây cà chua, promoter và terminator HSP 18.2 từ cây Arabidopsis thaliana.

2. Đã thiết kế thành công 3 cấu trúc vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter, pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter, pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter phục vụ chuyển gen miraculin vào dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cà chua.

3. Đã biểu hiện thành công protein miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 với hàm lượng từ 1,13-3,10 ng/µg protein tan tổng số; biểu hiện trong hệ thống rễ tơ thuốc lá, hàm lượng từ 13,7-19,97 ng/µg protein tan tổng số.

4. Đã tạo được 27 dòng cà chua mang chuyển gen miraculin trong đó 5 dòng mang bản đơn copy (T.E8.4, T.E8.7, T.E8.8, T.35S.2, T.35S8). Miraculin tái tổ hợp ở vỏ quả của các dòng được chuyển cấu trúc E8-pro/Mir/HSP-ter cao hơn so với các dòng 35S-pro/Mir/NOS-ter. Trong đó, dòng T.E8.8 (đạt 118,0 ng/µg protein tan tổng số) là cao nhất, gấp 4 lần so với các dòng T.35S.2, T.35S8. Miraculin tái tổ hợp được biểu hiện trong quả cà chua có hoạt tính tương tự miraculin trong quả thần kỳ tự nhiên.

NỘI DUNG:

MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài ..........................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................2
4. Ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn .......................................................................3
4.1. Ý nghĩa lý luận .................................................................................................3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..............................................................................................3
5. Đóng góp mới của luận án ......................................................................................3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................4
1.1. PROTEIN NGỌT, PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT VÀ MIRACULIN .....4
1.1.1. Protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt.....................................................4
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ và miraculin ..........................................6
1.2. TĂNG CƢỜNG SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG
THỰC VẬT...............................................................................................................14
1.2.1. Lựa chọn hệ thống biểu hiện .......................................................................14
1.2.2. Lựa chọn promoter (trình tự khởi đầu phiên mã) .......................................15
1.2.3. Ảnh hƣởng terminator đến sự biểu hiện của gen chuyển............................20
1.2.4. Thay đổi mã di truyền của gen đích cho phù hợp với hệ thống biểu hiện ..20
1.3. NGHIÊN CỨU VỀ CHUYỂN GEN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ
VÀ CÂY CÀ CHUA .................................................................................................22
1.3.1. Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2) .............22
1.3.2. Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật .................................................................24
1.3.3. Cây cà chua chuyển gen ..............................................................................25
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................30
2.1. VẬT LIỆU .........................................................................................................30
2.1.1. Vật liệu thực vật ..........................................................................................30
2.1.2. Vector và chủng vi khuẩn ...........................................................................30
2.1.3. Hóa chất và thiết bị máy móc ......................................................................31
2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...............................................................31
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................31
2.2.1. Thay đổi mã di truyền gen miraculin cho phù hợp với hệ thống biểu hiện ở
cây họ cà ................................................................................................................33
2.2.2. Thiết kế mồi ................................................................................................34
2.2.3. Phân lập promoter và terminator .................................................................34
2.2.4. Thiết kế vector chuyển gen mang gen miraculin ........................................38
2.2.5. Phƣơng pháp tạo dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển
gen .........................................................................................................................41
2.2.6. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen ....................................43
2.2.7. Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử .................44
2.2.8. Phân tích sự biểu hiện gen trong các dòng chuyển gen ..............................47
2.2.9. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm .....................................................48
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .....................................................................49
3.1. THAY ĐỔI MÃ DI TRUYỀN CỦA GEN MIRACULIN PHÙ HỢP VỚI HỆ
BIỂU HIỆN Ở CÂY HỌ CÀ. PHÂN LẬP PROMOTER E8, PROMOTER VÀ
TERMINATOR HSP 18.2 ........................................................................................49
3.1.1. Thay đổi mã di truyền của gen miraculin phù hợp với hệ biểu hiện ở cây
họ cà ......................................................................................................................49
3.1.2. Phân lập và tách dòng promoter E8 từ cà chua, promoter và terminator
HSP 18.2 từ Arabidopsis .......................................................................................51
3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MIRACULIN VÀO DÒNG TẾ BÀO
BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA .....................................................58
3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter ........................58
3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter .........................60
3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter ...........................62
3.2.4. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter ........................63
3.2.5. Biến nạp vector chuyển gen mang gen miraculin vào Agrobacterium .......65
3.3. BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO
BY2 VÀ HỆ THỐNG RỄ TƠ THUỐC LÁ .............................................................66
3.3.1. Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2...................66
3.3.2. Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong rễ tơ thuốc lá .........................71
3.4. BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG CÂY
CÀ CHUA .................................................................................................................79
3.4.1. Tạo dòng cà chua chuyển gen miraculin .....................................................79
3.4.2. Kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong các dòng cà chua bằng
kỹ thuật PCR .........................................................................................................83
3.4.3. Phân tích sự biểu hiện ở mức mRNA của gen miraculin trong một số dòng
cà chua chuyển gen ...............................................................................................84
3.4.4. Xác định số bản copy trong dòng cà chua chuyển gen bằng kỹ thuật
Southern ................................................................................................................85
3.4.5. Đánh giá một số chỉ tiêu sinh trƣởng của một số dòng cà chua
chuyển gen.............................................................................................................86
Chƣơng 4. THẢO LUẬN..........................................................................................91
4.1. Tăng cƣờng sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong thực vật .....................91
4.2. Biểu hiện miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 và rễ tơ thuốc lá .......94
4.3. Biểu hiện miraculin tái tổ hợp trong cây cà chua chuyển gen .......................99
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................104
NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............105
SUMMARY ............................................................................................................106
1. Overview: ........................................................................................................106
2. Objectives:.......................................................................................................107
3. Contents: .........................................................................................................107
4. Results: ............................................................................................................107
5. Discussion: ......................................................................................................108
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................112

LINK DOWNLOAD