Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ codioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học

Chất diệt cỏ chứa dioxin (chất diệt cỏ/dioxin) là một trong số các chất hữu cơ chứa clo độc hại không chỉ với môi trường, con người mà còn khó bị phân hủy bởi vi sinh vật (VSV). Xử lý ô nhiễm các chất hữu cơ chứa clo nói chung và chất diệt cỏ/dioxin nói riêng bằng biện pháp phân hủy sinh học (bioremediation) đã và đang được nghiên cứu do chi phí thấp và thân thiện đối với môi trường. Các nghiên cứu về quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo đã chứng minh có 4 con đường phân hủy, chuyển hóa bởi VSV. Trong số đó có 3 con đường xảy ra với sự có mặt của oxy bao gồm oxy hóa cắt vòng thơm, loại clo ở sản phẩm cắt vòng và phân hủy nhờ cơ chế xúc tác bởi enzyme ngoại bào hay các chất tương tự trao đổi chất hoạt động như enzyme. Quá trình thứ tư là loại khử clo xảy ra ở điều kiện không có oxy hay thiếu oxy được gọi chung là hô hấp loại khử clo.

Công nghệ phân hủy sinh học đã được áp dụng thành công với quy mô 0,5 m3đến 100 m3tại Đà Nẵng và quy mô 3.384 m3 tại Biên Hòa. Hiệu quả xử lý tại Đà Nẵng đạt 50 – 70% sau gần 2 năm xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005) và tại Biên Hòa đạt hơn 99% sau 27 tháng xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). Để đạt được hiệu quả xử lý nêu trên có rất nhiều yếu tố liên quan trong đó có vai trò của VSV, các điều kiện mini sinh thái của mỗi lô xử lý, các nhóm VSV tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy và khoáng hóa các hợp chất là thành phần chất diệt cỏ/dioxin. Đặc biệt, sự đa dạng và mức độ hoạt động của quần xã vi khuẩn kỵ khí (VK KK) hô hấp loại khử clo tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy sinh học các chất độc như thế nào vẫn đang là những câu hỏi cần được giải đáp bằng các nghiên cứu cơ bản với sự hỗ trợ của các kỹ thuật hiện hành.

Hiện nay, các nghiên cứu về VK hô hấp loại khử clo trên thế giới đã công bố có 20 chi và thuộc về 3 ngành là Proteobacteria, Chloroflexi và Firmicute. Trong các lô xử lý ở Đà Nẵng, sự có mặt VK Dehalococcoides thuộc ngành Chloroflexi đã được xác định bằng phương pháp DGGE (Nguyễn Bá Hữu, 2009). Một số VK KSF thuộc ngành Proteobacteria cũng đã được phát hiện tại khu vực này. Đặc biệt, 2 nhóm VK hô hấp loại khử clo theo cơ chế đồng trao đổi chất mà đại diện là Pseudomonas đã được phát hiện ở hầu hết các nghiên cứu ở Việt Nam (Nguyễn Bá Hữu, 2009). Chúng không chỉ có mặt trong các mẫu nguyên thủy mà còn luôn được tìm thấy ở hầu hết các mẫu của quá trình xử lý ở các quy mô khác nhau trong điều kiện thiếu khí. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu sâu nào về nhóm VK KK có khả năng hô hấp loại khử clo một cách có hệ thống. Đặc biệt, việc làm giàu các VK KK hô hấp loại khử clo bắt buộc bắt đầu được nghiên cứu nhưng chưa thành công. Đểtìm hiểu sự có mặt và vai trò của nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng và Biên Hòa, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học”.

NỘI DUNG:

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 5

1.1. Đặc điểm của các hợp chất hữu cơ chứa clo

1.1.1. Một số đặc điểm chung của các hợp chất hữu cơ chứa clo

1.1.2. Ảnh hƣởng của các hợp chất hữu cơ chứa clo tới con ngƣời và môi trƣờng

1.2. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo

1.2.1. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo trên thế giới 8

1.2.2. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo ở Việt Nam 9

1.2.2.1. Ô nhiễm các hợp chất hữu cơ nói chung 9

1.2.2.2. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Biên Hòa 10

1.2.2.3. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Đà Nẵng 11

1.2.2.4. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Phù Cát 11

1.3. Phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo 12

1.3.1. Cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo 12

1.3.2. Phân hủy hiếu khí chất diệt cỏ/dioxin 17

1.3.2.1. Phân hủy hiếu khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy 17

1.3.2.2. Phân hủy hiếu khí các hợp chất dioxin 18

1.3.3. Phân hủy kỵ khí chất diệt cỏ/dioxin 20

1.3.3.1. Phân hủy sinh học kỵ khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy 20

1.3.3.2. Phân hủy kỵ khí các hợp chất dioxin 21

1.4. Đa dạng các vi khuẩn tham gia hô hấp loại khử clo 21

1.4.1. Đặc điểm chung của các vi khuẩn hô hấp loại khử clo 21

1.4.2. Đa dạng vi khuẩn khử sulfate 25

1.4.3. Đa dạng vi khuẩn Dehalococcoides 28

1.4.4. Đa dạng vi khuẩn Pseudomonas 30

1.5. Đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình loại khử clo 32

1.6. Các phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng vi sinh vật 36

1.6.1. Phƣơng pháp vi sinh vật 36

1.6.2. Phƣơng pháp hóa sinh 37

1.6.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử 37

1.6.4. Phƣơng pháp Metagenomics 38

1.7. Các phƣơng pháp làm sạch nguồn ô nhiễm dioxin và các hợp chất tƣơng tự

bằng phân hủy sinh học

42

1.8. Nghiên cứu về phân hủy sinh học chất diệt cỏ chứa dioxin ở Việt Nam 45

1.8.1. Phân hủy sinh học ở lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng 46

1.8.2. Phân hủy sinh học ở lô xử lý tại sân bay Biên Hòa 48

1.8.3. Các nghiên cứu về vi khuẩn chuyển hóa và loại khử clo ở Việt Nam 49

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52

2.1. Vật liệu 52

2.1.1. Mẫu đất từ lô xử lý ở sân bay Đà Nẵng 52

2.1.2. Mẫu đất từ lô xử lý ở sân bay Biên Hòa 52

2.1.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi đã sử dụng 53

2.1.4. Các hóa chất và thiết bị máy móc 54

2.1.5. Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy và dung dịch đã sử dụng 55

2.1.5.1. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy 55

2.1.5.2. Các dung dịch đã sử dụng 56

2.2. Phƣơng pháp 56

2.2.1. Chiết các thành phần của chất diệt cỏ/dioxin từ đất 56

2.2.2. Tách DNA tổng số 57

v

2.2.3. Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí từ các lô xử lý 57

2.2.3.1. Nested-PCR 57

2.2.3.2. DGGE 58

2.2.4. Xác định trình tự nucleotide và xây dựng cây phát sinh chủng loại 59

2.2.5. Đánh giá sự biến động các vi khuẩn kỵ khí trong lô xử lý chất diệt

cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa

59

2.2.6. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí 59

2.2.6.1. Làm giàu vi khuẩn khử sulfate 59

2.2.6.2. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo 60

2.2.7. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên sự sinh trƣởng

của quần xã vi khuẩn khử sulfate

61

2.2.8. Làm sạch vi khuẩn khử sulfate 61

2.2.9. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn 62

2.2.10. Tách dòng đoạn gene mã hóa 16S rRNA 62

2.2.11.Đánh giá khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa clo (đa) vòng thơm 62

2.2.11.1. Đánh giá khả năng phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ 62

2.2.11.2.Đánh giá khả năng phân hủy các đồng phân dioxin trong mẫu làm giàu 63

2.2.11.3. Xác định 2,4-DCP và 2,4,5-T 64

2.2.12.Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí và gene chức năng trong mẫu làm giàu 65

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 67

3.1. Đa dạng vi khuẩn loại khử clo trong các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin 68

3.1.1. Đa dạng vi khuẩn hô hấp loại khử clo nói chung trong các lô xử lý 68

3.1.2. Đa dạng vi khuẩn khử sulfate trong các lô xử lý 69

3.1.3. Đa dạng vi khuẩn Dehalococcoides trong các lô xử lý 72

3.2. Sự đa dạng vi khuẩn và các gene chức năng trong mẫu làm giàu 74

3.2.1. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo trên đất ô nhiễm chất diệt

cỏ/dioxin

74

3.2.2. Sự đa dạng vi khuẩn trong mẫu làm giàu 75

3.3. Sự biến động số lƣợng vi khuẩn kỵ khí trong lô xử lý tại Biên Hòa 80

vi

3.3.1. Sự biến động số lƣợng vi khuẩn khử sulfate trong lô xử lý 80

3.3.2. Sự biến động số lƣợng vi khuẩn kỵ khí sử dụng chất diệt cỏ/dioxin tại lô xử lý 81

3.4. Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào 81

3.4.1. Sự có mặt của các gene reductive dehalogenase (rdhA) trong các lô xử lý

và trong mẫu làm giàu

81

3.4.2. Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế

bào phát hiện bằng Metagenomics

82

3.4.3. So sánh trình tự một số gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia vào

quá trình phân hủy các hợp chất vòng thơm

84

3.5. Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn khử sulfate 87

3.5.1. Làm giàu quần xã vi khuẩn khử sulfate 87

3.5.2. Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến sinh trƣởng của quần xã vi

khuẩn khử sulfate

87

3.5.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 88

3.5.2.2. Ảnh hƣởng của pH 88

3.5.2.3. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl 89

3.5.2.4. Ảnh hƣởng của nguồn carbon 90

3.5.2.5. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch chiết đất 91

3.5.2.6. Ảnh hƣởng của một số hợp chất chứa clo hữu cơ 91

3.5.3. Phân lập, phân loại vi khuẩn khử sulfate 92

3.5.3.1. Quan sát hình thái tế bào 93

3.5.3.2. Trình tự đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu cho vi khuẩn khử sulfate 93

3.6. Sự có mặt của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu 94

3.6.1. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí loại khử clo trên nguồn DCĐ, 2,4,5-T, 2,4-DCP 95

3.6.2. Hình thái một số tế bào vi khuẩn trong mẫu làm giàu trên các chất ô nhiễm 96

3.6.3. Nhân đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu của vi khuẩn Dehalococcoides 97

3.6.4. Trình tự đoạn gene 16S rRNA của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu 97

3.7. Khả năng phân hủy hay chuyển hóa các thành phần của chất diệt cỏ/dioxin 99

3.7.1. Khả năng phân hủy và chuyển hóa PCDD/Fs trong mẫu làm giàu 99

vii

3.7.2. Khả năng phân hủy và chuyển hóa 2,4-DCP, 2,4,5-T 102

3.7.2.1. Khả năng chuyển hóa 2,4,5-T 102

3.7.2.2. Khả năng chuyển hóa 2,4-DCP 103

3.7.3. Khả năng phân hủy các hợp chất chứa clo của vi khuẩn khử sulfate

BDN10T đã đƣợc làm sạch

104

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN

106

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

127

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

129

TÀI LIỆU THAM KHẢO

131

SUMMARY

LƯU Ý:

Tài liệu được chia sẻ bởi CTV EBOOKBKMT "Mân Trần Lê" chỉ được dùng sử dụng phục vụ mục đích học tập và nghiên cứu.

LINK DOWNLOAD

NỘI DUNG: