Đề tài phân biệt các loại thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu bằng kỹ thuật multiplex PCR

Đềtài “Phân biệt các loại thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà bằng kỹthuật multiplex - PCR” được tiến hành tại Viện Công nghệSinh học và Môi Trường, trường Đại học Nông Lâm TP. HCM từngày 15/10/2009 đến ngày 1/5/2010. Mục tiêu nghiên cứu là: xây dựng quy trình m-PCR phân biệt các loại thịt dê, cừu, heo, gà, bò lẫn trâu; ứng dụng quy trình m-PCR đểphát hiện 6 loại thịt trên trong các hỗn hợp DNA, hỗn hợp thịt không xửlý nhiệt, có xửlý nhiệt và mẫu bột thịt trên thịtrường làm nguyên liệu chếbiến thức ăn gia súc.

Kết quả đạt được nhưsau:

Đã xây dựng quy trình m-PCR phát hiện thịt heo, gà, dê, cừu, bò lẫn trâu. Tỷlệ thích hợp cho các primer FSIM:RG:RCh:RCB:RS:RP là 12: 7: 7:10: 5: 25 pmol. Quy trình này có thểáp dụng cho thịt tươi, thịt xửlý nhiệt ởnhiệt độ80oC/15’; 120oC/15’; 120oC/30’; 130oC/15’; 130oC/30’, 180oC/15’. Ảnh hưởng của tỷlệDNA hiện diện trong các hỗn hợp DNA và hỗn hợp thịt lên khảnăng phát hiện của m-PCR cũng được xác định. Đối với hỗn hợp DNA 6 loài có tỷlệbằng nhau, nồng độDNA thấp nhất mà m-PCR phát hiện gà là 0,0001 ng/μl, heo là 0,00025 ng/μl, cừu, dê, trâu/&bò là 0,0025 ng/μl. Còn đối với hỗn hợp DNA có nồng độgiảm dần của trâu, bò, dê, cừu, tỷlệthấp nhất mà m-PCR có thểphát hiện trâu/&bò, dê là 0,1%, cừu là 1%. Tỷlệgiống nhau

giữa hỗn hợp DNA và hỗn hợp thịt không xửlý nhiệt ảnh hưởng nhưnhau đến khảnăng phát hiện của m-PCR. M-PCR không phát hiện được thịt trâu/&bò, dê, cừu với tỷlệ ≤10% trong hỗn hợp thịt được xửlý ở130oC/30’.

NỘI DUNG:

SUMMARY.................................................................................................................... ii

DANH SÁCH CÁC CHỮVIẾT TẮT ............................................................................v

DANH SÁCH CÁC CHỮVIẾT TẮT ............................................................................v

DANH SÁCH CÁC HÌNH.............................................................................................vi

DANH SÁCH SƠ ĐỒ....................................................................................................vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG ......................................................................................... vii

Chương 1 .........................................................................................................................1

MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1

1.1. Đặt vấn đề.............................................................................................................1

1.2 Mục tiêu ................................................................................................................2

1.3 Mục đích ................................................................................................................2

Chương 2 .........................................................................................................................3

TỔNG QUAN..................................................................................................................3

2.1. Sơlược vềthịt và thịt chếbiến .............................................................................3

2.1.1 Giới thiệu sơlược vềthịt ................................................................................3

2.1.2 Giới thiệu sơlược vềthịt chếbiến ..................................................................4

2.1.3 Tình hình gian lận trên thịtrường thịt của thếgiới và Việt Nam ...................5

2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thịtrường thịt tươi và thịt chếbiến của thế

giới........................................................................................................................5

2.1.3.2 Tình hình gian lận trên thịtrường thịt tươi và thịt chếbiến ởViệt

Nam ......................................................................................................................5

2.2. Các phương pháp phát hiện thịt............................................................................6

2.2.1 Phương pháp dựa vào protein .........................................................................6

2.2.1.1 Phương pháp điện di.................................................................................6

2.2.1.2 Phương pháp miễn dịch............................................................................8

2.2.1.3. Phương pháp sắc ký.................................................................................9

2.2.2. Phương pháp dựa vào DNA...........................................................................9

2.2.2.1 Phương pháp lai DNA ..............................................................................9

2.2.2.2 Phương pháp dựa vào PCR ....................................................................11

2.3 DNA ty thểvà gen cytochrome b trong việc phát hiện loài ................................21

2.3.1 DNA ty thể....................................................................................................21

2.3.2 Di truyền của ty thể.......................................................................................25

2.3.3 Sửdụng gen cytochrome b đểphát hiện nguồn gốc loài trong các sản

phẩm thịt chếbiến ..................................................................................................25

2.4 Tổng quan các công trình nghiên cứu vềphát hiện loài của thịt bằng

phương pháp multiplex PCR .....................................................................................26

Chương 3 .......................................................................................................................29

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................................29

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành ..........................................................................29

3.2 Nội dung nghiên cứu...........................................................................................29

3.3 Vật liệu.................................................................................................................29

3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA..........................................................................29

3.3.2 Primer ............................................................................................................29

3.3.3 Hóa chất, thiết bịvà dụng cụ.........................................................................30

iv

3.4 Phương pháp tiến hành ........................................................................................30

3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu ....................................................................................30

3.4.2 Tách chiết DNA ............................................................................................31

3.4.3 Xây dựng quy trình m-PCR phát hiện thịt có nguồn gốc từheo, gà, dê,

cừu, bò và/hoặc trâu ...............................................................................................31

3.4.3.1 Phát hiện từng loại thịt bằng các phản ứng PCR đơn.............................31

3.4.3.2 Thiết lập và tối ưu hóa quy trình m-PCR ...............................................32

3.4.3.3 Thí nghiệm xác định khảnăng phát hiện thịt trâu của m-PCRError! Bookmark not

3.4.4 Ứng dụng m-PCR đểphát hiện thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà ......................32

3.4.4.1 Xác định giới hạn nồng độDNA có thểphát hiện được của m-PCR ....33

3.4.4.2 Thực hiện m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độgiảm dần

của trâu, bò, dê, cừu...........................................................................................33

3.4.4.3 Thực hiện m-PCR đểphát hiện thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong

các hỗn hợp thịt không xửlý nhiệt.....................................................................33

3.4.4.4 Thực hiện m-PCR đểphát hiện thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong

các hỗn hợp thịt xửlý nhiệt................................................................................34

3.4.4.5 Thực hiện m-PCR với bột thịt trên thịtrường........................................34

Chương 4 .......................................................................................................................37

KẾT QUẢTHẢO LUẬN .............................................................................................37

4.1 Xây dựng quy trình m-PCR.................................................................................37

4.1.1 PCR phát hiện từng loại thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu .................................37

4.1.2 Quá trình thiết lập và tối ưu hóa m-PCR ......................................................38

4.1.3 Thí nghiệm xác định khảnăng phát hiện thịt trâu của m-PCR.....................40

4.2 Ứng dụng m-PCR phát hiện thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà.................................40

4.2.1. Xác định giới hạn nồng độDNA mỗi loài có thểphát hiện được của

m-PCR....................................................................................................................40

4.2.2 M-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độgiảm dần của trâu, bò,

dê, cừu ....................................................................................................................42

4.2.3 M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt

không xửlý nhiệt ...................................................................................................43

4.2.4 M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt

xửlý nhiệt ..............................................................................................................44

4.2.4.1 Kết quảphát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp

thịt xửlý cùng nhiệt độvà thời gian...................................................................44

4.2.4.2 Kết quảso sánh m-PCR với thịt không xửlý nhiệt và thịt xửlý

nhiệt ởcùng nhóm tỷlệphối trộn ......................................................................47

4.2.5 M-PCR với bột thịt trên thịtrường ...............................................................50

Chương 5 .......................................................................................................................51

KẾT LUẬN VÀ ĐỀNGHỊ...........................................................................................51

5.1 Kết luận................................................................................................................51

5.2 Đềnghị.................................................................................................................51

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................52

PHỤLỤC

LINK DOWNLOAD

Kết quả đạt được nhưsau:

NỘI DUNG: