Chế tạo và nghiên cứu tính chất quang của hạt nano silica chứa tâm màu và thử nghiệm ứng dụng trong đánh dấu y sinh

Tôi xin trân trọng cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm Photonics – Viện Vật lý, Bộ Giáo dục và Đào tạo, Viện Vật lý và Phòng Sau đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm luận án. Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS. Viện trưởng Nguyễn Đại Hưng và TS. Nguyễn Thanh Bình đã tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận án của mình. Tôi xin cảm ơn NCS. Nguyễn Đình Hoàng, ThS. Nguyễn Thị Thanh Bảo đã giúp đỡ tôi thực hiện các phép đo quang học, phép đo thời gian sống và các phép đo tương quan huỳnh quang.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Quỳ, PGS.TS. Lê Quang Huấn, ThS. Trần Thanh Thủy, ThS. Lê Thị Thanh Xuân và cộng sự đã giúp đỡ tôi trong các thí nghiệm đánh dấu sinh học.

NỘI DUNG:

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ LIÊN QUAN .................................. 10

1.1. Chất màu hữu cơ .............................................................................................. 10

1.1.1. Cấu trúc hóa học ........................................................................................... 10

1.1.2. Cấu trúc mức năng lượng và các dịch chuyển quang học ............................ 11

1.1.3. Quang phổ của chất màu .............................................................................. 13

1.1.4. Độ ổn định quang học của các tâm màu hữu cơ ........................................... 15

1.1.5. Hiện tượng dập tắt vì nồng độ ...................................................................... 16

1.1.6. Ảnh hưởng của môi trường .......................................................................... 17

1.1.6.1. Ảnh hưởng của dung môi........................................................................... 17

1.1.6.2. Sự kết tụ các phân tử màu ......................................................................... 18

1.2. Các hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ ....................................................... 18

1.2.1. Các hạt nano silica và latex .......................................................................... 18

1.2.2. Các hạt nano silica/ormosil .......................................................................... 19

1.2.3. Phương pháp chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ ........................ 20

1.2.3.1. Phương pháp Stober ............................................................................

1.2.3.2. Các phương pháp micelle ....................................................................

1.2.4. Các đặc trưng hóa lý ...............................................................................

1.2.4.1. Vật liệu nền ..........................................................................................

1.2.4.2. Độ chói và độ bền quang .....................................................................

1.2.4.3. Thế Zeta................................................................................................

1.2.5. Các hạt nano silica hợp sinh ......................................................................... 26

1.2.5.1. Yêu cầu của các hạt nano silica hợp sinh ............................................

1.2.5.2. Sự gắn kết của hạt nano silica với phân tử sinh học ..........................

1.2.6. Ứng dụng các hạt nano silica trong y – sinh học.......................................... 31

1.2.6.1. Phép thử miễn dịch (silica nanoparticles – based immunoassays) ........... 31

1.2.6.2. Tăng độ nhạy trong phân tích và hiện ảnh sinh học ................................. 31

1.1.6.3. Đầu dò DNA siêu nhạy .............................................................................. 32

1.1.6.4. Phân tích đa kênh ...................................................................................... 32

1.1.6.5. Hiện ảnh tế bào ung thư và chẩn đoán ung thư sớm................................. 33

1.1.6.6. Máy đếm dòng tế bào (flow cytometer) ..................................................... 34

1.2.6.7. Vận chuyển thuốc ...................................................................................... 35

1.3. Các đối tượng sinh học .................................................................................... 36

1.3.1. Protein ........................................................................................................... 36

1.3.2. Albumin - protein bovine serum albumin (BSA) ........................................ 36

1.3.3. Strepavidin (SA) ........................................................................................... 37

1.3.4. Kháng thể ...................................................................................................... 37

1.3.5. Kháng nguyên ............................................................................................... 38

1.3.6. Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) .............................................................. 39

1.3.7. Phản ứng miễn dịch (phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể) ............ 39

1.3.7.1. Khái niệm................................................................................................... 39

1.3.7.2. Cơ chế kết hợp kháng nguyên và kháng thể .............................................. 39

1.4. Kết luận chương 1 ........................................................................................... 40

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM.............................................................................. 41

2.1. Các thí nghiệm chế tạo .................................................................................... 41

2.1.1. Chế tạo các hạt nano silica/ormosil (silica) chứa tâm màu RB bằng

phương pháp micelle thuận ....................................................................................

2.1.1.1. Chế tạo và chức năng hóa hạt nano silica chứa tâm màu RB .................. 41

2.1.1.2. Bọc hạt nano silica bằng protein............................................................... 46

2.1.1.3. Chế tạo mẫu cho nghiên cứu tính chất quang lý ....................................... 49

2.1.2. Chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp

micelle đảo ..............................................................................................................

2.1.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ FITC đến khả năng phản ứng với

APTES .....................................................................................................................

2.1.2.2. Chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu FITC ............................................ 51

2.1.3. Chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp

Stober ......................................................................................................................

2.1.3.1. Chế tạo hạt nano silica chứa FITC. Khảo sát ảnh hưởng của lượng

xúc tác lên kích thước hạt .......................................................................................

2.1.3.2. Chức năng hóa bề mặt hạt nano silica chứa FITC ................................... 54

2.2. Các phương pháp nghiên cứu thông số vật liệu .............................................. 55

2.2.1. Phương pháp nghiên cứu hình thái và kích thước hạt .................................. 55

2.2.1.1. Hiển vi điện tử quét (SEM) ........................................................................ 56

2.2.1.2. Hiển vi điện tử truyền qua (TEM) ............................................................. 56

2.2.2. Phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS)

xác định độ đơn phân tán, đường kính thủy động học và thế Zeta ........................

2.2.3. Phương pháp phổ huỳnh quang tương quan (Fluorescence Correlation

Spectroscopy – FCS) xác định kích thước hạt và hệ số khuếch tán .......................

2.2.4. Phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại xác định cấu trúc hóa học ................ 59

2.2.5. Các phương pháp nghiên cứu tính chất quang lý ......................................... 63

2.2.5.1. Phương pháp phổ hấp thụ ......................................................................... 63

2.2.5.2. Phương pháp phổ huỳnh quang................................................................. 64

2.2.5.3. Hiệu suất lượng tử ..................................................................................... 65

2.2.5.4. Thời gian sống phát quang ........................................................................ 67

2.2.6. Phương pháp và thiết bị sử dụng trong ứng dụng sinh học .......................... 68

2.2.6.1. Kính hiển vi quang học .............................................................................. 68

2.2.6.2. Thiết bị đếm tế bào trong dòng chảy ......................................................... 70

2.3. Kết luận chương 2 ........................................................................................... 71

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ CHẾ TẠO VÀ CÁC ĐẶC TRƯNG QUANG LÝ........ 73

3.1. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các nhóm chức năng khác nhau trên bề

mặt theo phương pháp micelle thuận .....................................................................

3.1.1. Hình dạng, kích thước hạt ............................................................................ 73

3.1.2. Cấu trúc hóa học ........................................................................................... 74

3.1.3. Đường kính thủy động học ........................................................................... 77

3.1.4. Các đặc trưng quang học .............................................................................. 80

3.1.4.1. Hấp thụ và huỳnh quang............................................................................ 80

3.1.4.2. Hiệu suất lượng tử và thời gian sống phát quang ..................................... 81

3.2. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các kích thước khác nhau theo phương

pháp micelle thuận ..................................................................................................

3.2.1. Đường kính thủy động học và thế Zeta (ζ) .................................................. 86

3.2.2. Các đặc trưng quang lý phụ thuộc vào kích thước hạt nano ........................ 88

3.2.2.1. Tính chất quang ......................................................................................... 88

3.2.2.2. Độ phân cực huỳnh quang ......................................................................... 92

3.2.3.3. Kết quả đo kích thước hạt và hệ số khuếch tán bằng phương pháp

FCS .........................................................................................................................

3.3. Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein Bovine serum albumine (BSA) ...... 95

3.3.1. Hình dạng, kích thước .................................................................................. 95

3.3.2. Tính chất quang ............................................................................................ 96

3.4. Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein streptavidin (SA) ............................ 98

3.4.1. Hình dạng, kích thước .................................................................................. 98

3.4.2. Tính chất quang ............................................................................................ 98

3.4.2.1. Phổ huỳnh quang trong nước .................................................................... 98

3.4.2.2. Phổ huỳnh quang hạt nano silica bọc protein trong PBS ......................... 99

3.5. Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp micelle đảo ...................... 100

3.5.1. Ảnh hưởng của lượng ethanol đến khả năng phản ứng của FITC với

100

APTES ....................................................................................................................

3.5.2. Tính chất quang ............................................................................................ 102

3.6. Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp Stober .............................. 104

3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của lượng xúc tác lên kích thước hạt........................... 104

3.6.2. Tính chất quang ............................................................................................ 105

3.6.3. Chức năng hóa .............................................................................................. 107

3.6.3.1. Kết quả chức năng hóa hạt nano bằng nhóm chức NH2 ........................... 107

3.6.3.2. Kết quả dập tắt nhóm OH trên bề mặt hạt ................................................ 108

3.6.3.3. Chức năng hóa hạt nano silica bằng nhóm chức COOH.......................... 110

3.7. Kết luận chương 3 ........................................................................................... 112

CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG HẠT NANO SILICA LÀM CHẤT ĐÁNH DẤU

114

SINH HỌC .............................................................................................................

4.1. Thí nghiệm ứng dụng hạt nano silica làm chất đánh dấu y – sinh .................. 114

4.1.1. Thí nghiệm phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng phương pháp miễn

114

dịch huỳnh quang....................................................................................................

4.1.1.1. Chế tạo phức hệ SiO2RB@KT đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 .......... 114

4.1.1.2. Sử dụng phức hệ SiO2RB@KT để nhận biết tế bào vi khuẩn E. coli

114

O157 :H7 ................................................................................................................

4.1.1.3. Hiện ảnh tế bào ......................................................................................... 114

4.1.1.4. Xây dựng phương pháp phổ quang học để xác định số lượng vi khuẩn ... 115

4.1.2. Phát hiện tế bào ung thư vú .......................................................................... 115

4.1.2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất ...................................................................... 115

4.1.2.2. Chế tạo phức hệ hạt nano silica chứa RB - kháng thể HER2

115

(SiO2RB@HER2) ....................................................................................................

4.1.2.3. Nuôi cấy tế bào .......................................................................................... 115

4.1.2.4. Sử dụng phức hệ SiO2RB@HER2 để nhận biết tế bào ung thư vú KPL4

4.1.2.5. Thí nghiệm đếm tế bào trong dòng chảy ................................................... 116

4.1.3. Phát hiện tế bào ung thư vú BT-474 ............................................................. 116

4.1.3.1. Chế tạo phức hệ hạt nano silica chứa FITC – kháng thể HER2

116

(SiO2FITC@HER2) ................................................................................................

2.1.3.2. Nhận biết tế bào BT-474bằng phức hệ SiO2FITC@HER2 ....................... 116

4.2. Kết quả phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng phương pháp miễn dịch

117

huỳnh quang ...........................................................................................................

4.2.1. Ảnh chụp trên kính hiển vi huỳnh quang ..................................................... 117

4.2.2. Xây dựng phương pháp quang phổ huỳnh quang xác định định lượng vi

119

khuẩn E. coli O157:H7 ...........................................................................................

4.3. Nhận biết tế bào ung thư vú ............................................................................ 121

4.3.1. Phát hiện tế bào ung thư vú bằng ảnh hiển vi huỳnh quang ........................ 121

4.3.2. Phát hiện định lượng tế bào ung thư vú bằng thiết bị đếm tế bào ............... 124

4.4. Phát hiện tế bào ung thư vú bằng hạt nano silica chứa tâm màu FITC ........... 127

4.5. Kết luận chương 4 ........................................................................................... 127

KẾT LUẬN ............................................................................................................ 129

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC SỬ DỤNG TRONG LUẬN

131

ÁN ..........................................................................................................................

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................... 133

LINK DOWNLOAD